熱休克蛋白27促進人肝細胞肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制研究.pdf

1、第一部分 轉(zhuǎn)移潛能不同肝癌細胞系中HSP27的表達及轉(zhuǎn)移相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因組學(xué)分析 本部分的研究是應(yīng)用細胞免疫熒光檢測技術(shù)結(jié)合反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，實時熒光定量PCR，蛋白印跡(western blot)及免疫酶聯(lián)吸附實驗(ELISA)等技術(shù)，對轉(zhuǎn)移潛能不同的人肝細胞肝癌細胞系Hep3B、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM6中HSP27的定位及表達進行分析。運用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，觀察HSP27與肝癌

2、細胞侵襲遷移能力的關(guān)系。另外，利用基因芯片檢測技術(shù)，比較MHCC97L、MHCC97H、HCCLM6細胞系信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達譜的差異，運用KOBAS軟件分析系統(tǒng)對差異基因所涉及的信號通路進行統(tǒng)計分析，篩查在肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能形成過程中發(fā)揮重要作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 應(yīng)用細胞免疫熒光技術(shù)檢測HSP27在體外培養(yǎng)肝癌細胞系中的定位，結(jié)果顯示HSP27主要定位在肝癌細胞細胞漿內(nèi)，亦見于細胞核。通過RT-PCR、實時熒光定量PCR技術(shù)檢測

3、HSP27的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)HSP27在有轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系MHCC97L、MHCC97H、HCCLM6中mRNA表達水平明顯高于無轉(zhuǎn)移潛能的Hep3B，其中HCCLM6細胞系最高。利用western blot和HSP27蛋白EIJSA方法，證實在四種肝癌細胞系中HSP27蛋白表達水平與上述mRNA水平一致。此外，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，設(shè)置三個平行實驗組：對照組(HCCLM6細胞)、MOCK組(轉(zhuǎn)染一小段非特異性dsRNA，但該dsR

4、NA不針對任何基因，經(jīng)驗證轉(zhuǎn)染后不抑制基因表達)和RNA干擾組(轉(zhuǎn)染HSP27特異性dsRNA)。在轉(zhuǎn)染100nM HSP27特異性siRNA 36、48小時后，HCCLM6細胞內(nèi)HSP27mRNA均下降了80％以上而蛋白水平分別與70％、92％；與MOCK組相比，RNA干擾組侵襲和遷移的HCCLM6細胞數(shù)分別下降了53％與64％。這些結(jié)果提示HSP27參與了肝癌細胞侵襲遷移過程，它的高表達可能與肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的增高有關(guān)。 第

5、二部分 HSP27經(jīng)由PKC．-ERK/p38 MAPK信號通路促進肝癌轉(zhuǎn)移的分子機制研究 本部分的研究目的是應(yīng)用RNA干擾技術(shù)結(jié)合激酶特異性抑制劑和激動劑、蛋白免疫印跡技術(shù)、體外侵襲遷移實驗，探討肝細胞肝癌細胞內(nèi)MAPK通路與HSP27的關(guān)系，證實通路中關(guān)鍵靶標分子的功能效應(yīng)，揭示其在肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能形成中的作用，以獲得潛在的肝癌診斷標記及治療靶標。 本研究應(yīng)用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測MHCC97L、MHCC97H、HCC

6、LM6肝癌細胞中HSP27和MAPK通路三個關(guān)鍵活性分子ERK1/2、p38MAPK、JNK及顯著差異表達基因PKC．的蛋白磷酸化水平，結(jié)果顯示在三種轉(zhuǎn)移性肝癌細胞內(nèi)磷酸化HSP27、磷酸化PKC．和磷酸化ERK1/2、磷酸化p38 MAPK逐漸增高，而磷酸化JNK沒有明顯變化，這提示HSP27、PKC．的持續(xù)活化及ERK1/2和p38MAPK通路的激活可能與肝癌細胞轉(zhuǎn)移能力增強有關(guān)。 綜合以上結(jié)果，表明HSP27作為PKC．-

7、ERK/p38 MAPK下游的活性分子在肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮著重要作用。 第三部分 HSP27在轉(zhuǎn)移潛能不同肝癌細胞內(nèi)參與核因子-B通路激活的分子機制研究 轉(zhuǎn)移是腫瘤最重要的惡性表型之一，是多分子參與高度復(fù)雜有序的過程。越來越多的證據(jù)顯示細胞凋亡與腫瘤轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。大量證據(jù)表明，HSP27可以作用于凋亡通路上的多個環(huán)節(jié)，抑制細胞凋亡，使損傷刺激下的細胞存活率顯著提高，它在不同信號通路中所起的作用與細胞內(nèi)的其他凋亡

8、信號分子組成了一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。本部分的研究目的就是探討在人類肝細胞肝癌細胞系中HSP27與細胞凋亡的關(guān)系，并進一步分析其參與肝癌細胞凋亡的分子機制及其與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的內(nèi)在聯(lián)系。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，抑制高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系MHCC97H的HSP27的表達。瞬時轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的雙鏈HSP27小干擾RNA(siRNA，100nM)后，檢測到MHCC97H細胞中HSP27的mRNA和蛋白表達均受到明顯抑制。以MHCC97H細胞作為試驗的細胞

9、模型，設(shè)置對照組(MHCC97H細胞)、MOCK組(轉(zhuǎn)染非特異性的陰性對照dsRNA)、RNAi組(轉(zhuǎn)染HSP27 siRNA)3個試驗平行組，應(yīng)用流式細胞儀分析(JC-1標記)和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(TIYNEL)，觀察HSP27對MHCC97H細胞凋亡比例的影響。應(yīng)用流式細胞儀分析顯示，與MOCK組相比，RNAi組中MHCC97H細胞凋亡比例增加了20.07％，HSP27 RNA干擾后MHCC97H細胞凋亡比

10、例明顯增加。TUNEL 法標記細胞核也顯示HSP27。RNA干擾后MHCC97H細胞凋亡比例增加。 取對照組、MOCK組和RNAi組細胞進行人類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片的檢測，結(jié)果顯示 RNAi 組中 IL2(0.12±0.019)、LTA(0.38±0.029)、NFKB1(NF.B 0.03±0.027)、NFKBIA(I.B.0.27±0.033)、PECAMl(0.43±0.026)均出現(xiàn)明顯下調(diào)，并經(jīng)實時定量PCR證

11、實。通過pathway miner軟件分析，這些基因均位于NF-.B通路，提示HSP27與細胞內(nèi)NF-.B通路的激活相關(guān)。應(yīng)用蛋白印跡與免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)，HSP27干擾實驗后，MHCC97H細胞核內(nèi)活化的NF-.Bp65減少，細胞內(nèi)磷酸化的I.B.也減少，說明HSP27影響了肝癌細胞內(nèi)NF-.B通路的激活；對不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞細胞核內(nèi)活化的NF-.B p65檢測發(fā)現(xiàn)，Hep3B、MHCC97L 及MHCC97H細胞核內(nèi)活化的NF-.

12、B p65蛋白隨轉(zhuǎn)移潛能的增加而增高；在三種肝癌細胞中HSP27可同IKK.、I.B.共沉淀，而不能與活化的NF-.B p65共沉淀；同時IKK.免疫共沉淀結(jié)果顯示，HSP27干擾實驗后，IKK.與IKK.的結(jié)合減少，說明HSP27的缺失降低了IKK復(fù)合物的穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明HSP27的抗凋亡作用可能是通過參與肝癌細胞內(nèi)NF-.B通路的活化所致。 結(jié)論： 1.HSP27的高表達可能與肝細胞肝癌的轉(zhuǎn)移潛能正相關(guān)。

13、 2. 轉(zhuǎn)移潛能不同肝細胞肝癌細胞的基因表達譜存在明顯的差異性，涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，表明肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化相關(guān)。其中MAPK通路、凋亡通路發(fā)揮著重要作用。 3．PKC．-ERK1/2/p38 MAPK-HSP27通路的活化在肝癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。 4．HSP27可通過與NF-．B通路中IKK．及I．B．成分的相互作用及影響IKK復(fù)合物的穩(wěn)定性來參與肝癌細胞內(nèi)NF-．B途徑的激活，抑制肝