Net1蛋白促進(jìn)肝癌細(xì)胞MHCC-97H侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌(HCC)在中國(guó)和亞非其他國(guó)家是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，在中國(guó)其死亡率居各種惡性腫瘤死亡率的第二位。迄今為止，大量研究顯示HCC中存在很多畸變表達(dá)基因，然而，能夠幫助識(shí)別早期腫瘤復(fù)發(fā)并可作為潛在治療靶點(diǎn)的分子標(biāo)志物仍然很有限。神經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因1(neuroepithelial celltransforming gene1，Netl)最初是從神經(jīng)上皮瘤中分離鑒定出來(lái)的。其突變型可以轉(zhuǎn)化NIH3T3細(xì)胞，因此被認(rèn)為是癌基因。N

2、etl蛋白是RhoA.蛋白特異性的鳥(niǎo)苷酸交換因子(GEFs)，通過(guò)DH.PH結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)GTP與RhoA蛋白的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)RhoA蛋白的活性，參與調(diào)控了多種生物學(xué)行為，如細(xì)胞骨架的構(gòu)成，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移，細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附等等。有研究表明，Netl蛋白激活RhoA蛋白可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在穩(wěn)定狀態(tài)下，由于核定位信號(hào)(NLS)的存在，Netl蛋白定位于細(xì)胞核。缺失核定位信號(hào)(NLS)可以使Netl蛋白重新分布

3、于細(xì)胞漿中，并且活化RhoA蛋白，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合形成張力絲。另一方面Netl蛋白可以通過(guò)C端的PDZ結(jié)合基序和腫瘤抑制蛋白Dig蛋白家族成員結(jié)合，使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而發(fā)揮抑瘤作用。Netl蛋白重新定位于細(xì)胞漿激活RhoA蛋白是Netl蛋白轉(zhuǎn)化細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。Netl蛋白的生物信息學(xué)特征和研究結(jié)果提示Netl基因可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。本研究通過(guò)大樣本檢測(cè)Netl蛋白在肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)水平，并分析其和預(yù)后的關(guān)系；進(jìn)一

4、步通過(guò)分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究其具體分子機(jī)制；從而初步闡明Netl蛋白在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的機(jī)制及其意義。
　　 方法：采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)368例HCC及距腫瘤邊緣至少2cm的癌旁肝組織(癌組織均經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞)樣本中Netl的表達(dá)水平。通過(guò)Kaplan-Meier生存曲線和多元變量Cox回歸統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其和預(yù)后的關(guān)系。進(jìn)一步使用RNA干擾技術(shù)，干擾高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MFtCC-97H的Netl蛋白的表達(dá)；運(yùn)用生長(zhǎng)曲線

5、、MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)以及裸鼠轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)研究Netl蛋白對(duì)高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。最后采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選Netl交互作用蛋白；并用免疫共沉淀的方法明確了交互作用的具體機(jī)制和意義。
　　 結(jié)果：在368例HCC組織中Netl呈高表達(dá)并且表達(dá)的陽(yáng)性率達(dá)到86.7％(319/368)，與Edmondson.Steiner分級(jí)(P=0.02)以及TNM分期(P=0.01)呈正相關(guān)。Netl表達(dá)水平與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移

6、(P=0.008)和門靜脈侵潤(rùn)(P=0.007)呈正相關(guān)。高表達(dá)Netl的HCC病人比具有低表達(dá)Netl或表達(dá)缺失Netl(分別為P=0.001和P=0.002)的病人具有更短的無(wú)病存活期或者總存活期。多元Cox回歸分析表明Netl蛋白表達(dá)(相對(duì)危險(xiǎn)性RR，5.8；P=0.01)對(duì)HCC病人是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)因素。
　　 由于Netl在肝細(xì)胞癌病人中為高表達(dá)，并且HCC組織中的Netl表達(dá)水平跟肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(P=0.008)和門靜

7、脈侵潤(rùn)(P=0.007)呈正相關(guān)。提示高表達(dá)的Netl蛋白水平促進(jìn)了肝癌細(xì)胞向體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移。為了證實(shí)這一假說(shuō)，我們使用RNA干擾技術(shù)，干擾高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC-97H的Netl蛋白的表達(dá)。生長(zhǎng)曲線和MTT實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)Netl蛋白的表達(dá)水平對(duì)MHCC-97H細(xì)胞的增殖能力沒(méi)用明顯作用；劃痕實(shí)驗(yàn)，基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)以及裸鼠轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)Netl蛋白的表達(dá)水平能夠明顯抑制MI-tCC.97H細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　

8、 采用了酵母雙雜交系統(tǒng)篩選Netl交互作用蛋白。篩選出Merlin和Netl蛋白具有交互作用。采用特異性酵母雙雜交以及免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了Netl與Merlin之間的交互作用。Merlin是NF2基因的編碼產(chǎn)物，NF2基因是腦瘤的一個(gè)著名的抑瘤基因，在多種腦腫瘤里表達(dá)缺失。我們的研究發(fā)現(xiàn)，將NF2基因轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌細(xì)胞系MHCC-97H中，可以明顯下調(diào)Netl蛋白的表達(dá)；并且隨著NF2基因產(chǎn)物Merlin的表達(dá)依次增高，Netl的表達(dá)

9、則依次降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Merlin可以促進(jìn)Netl在細(xì)胞內(nèi)的泛素化。將pCMV.NF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)MHCC-97H細(xì)胞，然后用不同濃度的MGl32處理，裂解細(xì)胞，用Netl抗體進(jìn)行免疫沉淀，再用泛素抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。結(jié)果表明，Netl被泛素化，并且隨著MGl32濃度的增高，泛素化的Netl也依次增高。同樣的，將pCMV.NF2質(zhì)粒(2μg)轉(zhuǎn)染進(jìn)MHCC-97H細(xì)胞，然后用不同濃度的MGl32處理15小時(shí)，裂解細(xì)

10、胞，用泛素親和瓊脂糖珠子免疫沉淀，再用Netl抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。結(jié)果同樣顯示：Netl被泛素化，并且隨著MGl32濃度的增高，泛素化的Netl也依次增高。另外將不同量的pCMV.NF2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)MHCC-97H細(xì)胞，逐漸增加Merlin的表達(dá)量，各組用相同濃度的MGl32(5μM)處理15小時(shí)，裂解細(xì)胞，用Netl抗體進(jìn)行免疫沉淀，再用泛素抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，隨著Merlin的表達(dá)的增加，可以逐

11、步增加Netl蛋白的泛素化。這些結(jié)果說(shuō)明了在細(xì)胞內(nèi)Merlin可以促進(jìn)Netl蛋白的泛素化，并使其通過(guò)蛋白酶體降解。
　　 結(jié)論：本研究通過(guò)檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者中的Netl蛋白表達(dá)水平，明確了在肝癌患者中Netl蛋白表達(dá)上調(diào)并且和轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)；下調(diào)Netl蛋白的表達(dá)水平可以明顯抑制MHCC-97H細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)以及侵襲轉(zhuǎn)移能力；篩選并證實(shí)了Merlin和Netl蛋白發(fā)生交互作用；在細(xì)胞內(nèi)Merlin可以促進(jìn)Netl蛋白的泛素化，并