PDCD4抑制人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的研究.pdf

1、研究背景：
　　 原發(fā)性肝癌主要是肝細(xì)胞性肝癌，是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率逐年增長(zhǎng)。我國(guó)原發(fā)性肝癌的發(fā)病人數(shù)約占全球的55％，死亡人數(shù)位居惡性腫瘤的第二位。原發(fā)性肝癌的自然生存期僅為1～3個(gè)月。由于起病隱匿，超過(guò)80％的患者就診時(shí)已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)。能夠手術(shù)的患者術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)率可達(dá)50％，5年生存率僅為25～39％。影響原發(fā)性肝癌的預(yù)后的主要因素是其高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率，而轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的發(fā)生與癌細(xì)胞的生物學(xué)行為、細(xì)胞外基

2、質(zhì)、機(jī)體免疫與腫瘤血管生成等因素密切相關(guān)。肝癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是一個(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，涉及到細(xì)胞基因改變，表面結(jié)構(gòu)、抗原性、侵襲力、粘附能力、血管生成的能力以及腫瘤細(xì)胞與宿主、腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)之間相互作用等多方面。研究顯示，肝癌轉(zhuǎn)移基因、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的激活與轉(zhuǎn)移抑制基因的失活在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。
　　 惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移往往伴隨著血管的生成。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)新生血管形成的作用。研究表明，VEGF的表達(dá)

3、與腫瘤的微血管數(shù)量、局部進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫落、與細(xì)胞外基質(zhì)粘附并將其降解是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。ECM主要由Ⅳ型膠原、糖蛋白及蛋白多糖等組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，Ⅳ膠原是其主要支架。ECM的降解必須依賴基質(zhì)金屬蛋白酶，其中最主要的就是MMP-2和MMP-9，因?yàn)樗鼈兊淖饔玫孜锸洽裟z原。大量的研究表明，肝癌細(xì)胞分泌的MMPs在降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。
　　 MTA1是一

4、個(gè)在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中表達(dá)上調(diào)的基因，是腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)移基因MTA家族的成員，主要參與組成具有核小體重塑活性的組蛋白去乙?；?，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄具有抑制作用，并通過(guò)調(diào)節(jié)雌激素通路、細(xì)胞骨架和細(xì)胞凋亡等途徑促進(jìn)多種上皮源性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 目的：本課題研究旨在研究PDCD4在不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)，并且通過(guò)構(gòu)建表達(dá)PDCD4基因的真核質(zhì)粒載體，并且將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PDCD4表達(dá)水平較低的人肝癌細(xì)胞株中，進(jìn)一步探討PDCD4對(duì)人

5、肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移潛能的作用，從而為肝癌的治療尋求一種有利途徑。
　　 方法：
　　 1.PDCD4在不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞中的表達(dá)：
　　 應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和Western blots法及實(shí)時(shí)定量PCR三種方法對(duì)三種具有不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H、MHCC-97L和Hep3B中的PDCD4的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；
　　 2.人PDCD4基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建：
　　 以正常人肝細(xì)胞

6、株L02細(xì)胞的cDNA為模板，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增PDCD4基因編碼區(qū)的全部序列，克隆入pGEM-T載體中，經(jīng)限制性內(nèi)切酶、DNA序列分析鑒定目的基因后，定向亞克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，并進(jìn)行雙酶切鑒定；
　　 3.PDCD4對(duì)人肝癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移潛能的抑制作用：
　　 (1)首先將PDCD4的真核表達(dá)質(zhì)粒在眞核細(xì)胞E.coli中擴(kuò)增，用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒抽提，用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染

7、試劑將pcDNA3.1-PDCD4、pcDNA3.1-vector分別轉(zhuǎn)染入PDCD4表達(dá)水平低的高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞MHCC-97H中，在含400ug/L G418的選擇性培養(yǎng)基中篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。利用Western blots法對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行鑒定。
　　 (2)分組：以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PDCD4的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-vector及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組。
　　 (3)用MT方法檢

8、測(cè)PDCD4對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響；用流式細(xì)胞術(shù)分析PDCD4對(duì)細(xì)胞周期的作用；
　　 (4)用Hoechst33258染色對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)，用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)；
　　 (5)通過(guò)transwell小室對(duì)轉(zhuǎn)染前后MHCC-97H細(xì)胞的遷徙和侵襲能力進(jìn)行評(píng)估；
　　 (6)用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因VEGF、MMP-2、MMP-9及MTA1在轉(zhuǎn)染前后的肝癌細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　

9、 結(jié)果：
　　 1.PDCD4在人肝癌細(xì)胞中的表達(dá)：
　　 (1)免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示PDCD4表達(dá)于細(xì)胞漿中。PDCD4在人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H、MHCC-97L和Hep3B的免疫細(xì)胞化學(xué)染色評(píng)分分別是0.85±0.17，1.46±0.36和1.97±0.29，三者之間有顯著性差異；
　　 (2)western blots法分析顯示PDCD4在MHCC-97H、MHCC-97L和Hep3B的相對(duì)強(qiáng)度RD分

10、別為0.053±0.045，0.268±0.067和0.587±0.182，三者之間差異顯著；
　　 (3)實(shí)時(shí)定量PCR方法將顯示PDCD4在MHCC-97H、MHCC-97L細(xì)胞中的表達(dá)的相對(duì)定量值(相對(duì)于在Hep3B的表達(dá)量)分別是0.126±0.023 and0.385±0.084，二者之間有顯著性差異。
　　 2.PDCD4真核表達(dá)載體的構(gòu)建：
　　 (1)PCR擴(kuò)增的特異性片段長(zhǎng)度為1972 bp，以

11、此構(gòu)建的pGEM-T-PDCD4克隆載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切證實(shí)載體中帶有PDCD4基因的目的片段，與GenBank中的人PDCD4基因cDNA序列一致。
　　 (2)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-PDCD4經(jīng)KpnⅠ/xbaⅠ雙酶切后顯示5.1kb和2000bp左右的2個(gè)條帶，證明pdcd4基因已成功克隆到了真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中。Western blots分析證實(shí)轉(zhuǎn)染有效。
　　 3.PDCD4對(duì)人肝癌

12、細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移潛能的抑制作用：
　　 (1)PDCD4顯著抑制HCC細(xì)胞增殖，阻滯HCC細(xì)胞周期。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，PDCD4組在490nm的吸光度是0.135±0.011，明顯低于空載體組(0.218±0.011)及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(0.242±0.014)， P＜0.01?？蛰d體組與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，PDCD4阻滯肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，Gl期及G2期的百分比指數(shù)(percentage in

13、dex，PI)在PDCD4組、空載體組與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組分別是27.83±0.95％，42.47±2.90％和44.47±2.37％，PDCD4組與空載體組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組之間有明顯差異(P＜0.05)，而后兩者之間無(wú)明顯差異。
　　 (2)PDCD4促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)顯示，PDCD4組、空載體組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率分別是41.27±2.73％、12.61±3.00％和12.61±3.00％；Hoechst33258染

14、色顯示，凋亡細(xì)胞百分率在PDCD4組是55.62±10.11％，在空載體組是，6.06±2.06％，未轉(zhuǎn)染組是3.12±0.73％。PDCD4組與空載體組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組之間有明顯差異(P＜0.01)，而后兩者之間無(wú)明顯差異。
　　 (3)PDCD4抑制肝癌細(xì)胞遷徙及侵襲能力。遷徙實(shí)驗(yàn)顯示，平均每視野中遷徙細(xì)胞數(shù)在PDCD4組是32.00±7.01，明顯低于空載體組的174.20±16.64或未轉(zhuǎn)染組的193.60±23.72；在

15、侵襲實(shí)驗(yàn)中，平均每視野中的遷移細(xì)胞數(shù)在PDCD4組、空載體組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別是10.20±1.39，33.00±4.30和45.00±5.70。PDCD4組與空載體組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組之間有明顯差異(P＜0.01)?？蛰d體組與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 (4)PDCD4對(duì)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的影響：PDCD4抑制VEGF、MMP-9及MTA1基因的表達(dá)，對(duì)MMP-2的抑制作用不明顯。相對(duì)于未轉(zhuǎn)染組，PDCD4組及空載

16、體組的VEGF mRNA的相對(duì)定量值RQ分別是0.424±0.040和0.900±0.135，兩組之間差異顯著(P＜0.05)；MMP-2 mRNA的RQ分別是0.437±0.020和0.717±0.120，兩組之間無(wú)明顯差異，(P＞0.05)；MMP-9 mRNA的RQ分別是0.448±0.098和0.882±0.164，兩組之間差異顯著(P＜0.05)；MTA1 mRNA的RQ分別是0.187±0.083和0.652±0.105，兩

17、組之間差異顯著(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 我們的結(jié)果顯示，PDCD4在具有高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H中的表達(dá)水平水平最低，而在無(wú)轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株Hep3B中表達(dá)最低。PDCD4的表達(dá)水平與人肝癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移潛能負(fù)相關(guān)，提示PDCD4對(duì)人肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能可能有抑制作用。PDCD4可以降低肝癌細(xì)胞活力，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞的遷徙和侵襲能力，并且抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)基因VEGF、MMP-9及M

18、TA1的表達(dá)，提示PDCD4對(duì)人肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能具有抑制作用。
　　 意義：
　　 有關(guān)PDCD4的研究顯示，該基因?qū)δ[瘤細(xì)胞具有抑制作用，可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，但是目前有關(guān)PDCD4對(duì)人肝癌細(xì)胞的作用的研究很少。本課題利用已經(jīng)構(gòu)建好的不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株對(duì)PDCD4抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能進(jìn)行研究，為PDCD4對(duì)肝癌的治療作用提供了有力的依據(jù)。以往的研究顯示腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原MTA1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，我