DNMT3b、PDCD4在肝癌中的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、DNA甲基化是DNA的一種天然修飾方式,也是表觀遺傳學(xué)研究的重要方面之一,這種調(diào)節(jié)不改變DNA序列,并且是可逆的,在基因表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)、基因組印跡、X染色體失活、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要的作用。DNA甲基化是通過DNMTs催化完成的,DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3b(DNMT3b)是其中重要的一種,主要催化CpG島區(qū)域的從頭甲基化,目前已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤中DNMT3b表達(dá)增高,而過表達(dá)的DNMT3b將導(dǎo)致多種抑癌基因高甲基化而失活,在腫瘤的發(fā)生

2、發(fā)展過程中起重要作用。程序性細(xì)胞凋亡因子4(PDCD4)基因是一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的抑癌基因,可能作用于翻譯啟動(dòng)因子eIF4A、eIF4G,從而在蛋白翻譯水平抑制細(xì)胞生長。其在肺癌、消化道腫瘤中表達(dá)下降,并通過caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但對(duì)于其表達(dá)下降的機(jī)制尚不清楚。研究表明,PDCD4基因啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)CpG島,因此推測(cè)其表達(dá)調(diào)節(jié)可能與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶有關(guān)。
　　一、目的：本文旨在研究DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3b、抑癌基因程

3、序性細(xì)胞死亡因子4在肝癌組織及肝癌細(xì)胞株中的表達(dá),探討兩者之間作用機(jī)制,并分析PDCD4在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用和臨床意義。
　　二、方法：1.免疫組化法觀察DNMT3b,PDCD4在肝癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織中的表達(dá),分析其表達(dá)的相關(guān)性,并同時(shí)分析PDCD4與肝癌病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系;2.培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721,提取總蛋白和基因組DNA備用;3.用不同濃度的甲基化酶抑制劑5-aza-CdR培養(yǎng)SMMC7721細(xì)胞,并提

4、取其中兩組細(xì)胞總蛋白和基因組DNA備用;4.分別用Western-blotting技術(shù)和MSP(甲基化特異性PCR)技術(shù)檢測(cè)5-aza-CdR處理前后細(xì)胞中DNMT3b和PDCD4的表達(dá)改變以及PDCD4基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀況;5.用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,得出結(jié)論。
　　三、結(jié)果：1.PDCD4在肝癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織的陽性表達(dá)率分別為34.72％、45.83％、70.97％,正常組與癌組織、癌旁組織間有差

5、異,正常組低于癌組織、癌旁組織,而癌組織、癌旁組織間無差異;DNMT3b肝癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織的陽性表達(dá)率分別為70.83％、59.72％、35.48％,正常組與癌組織、癌旁組織間有差異,正常組高于癌組織、癌旁組織,而癌組織、癌旁組織間亦無差異。癌組織中PDCD4與DNMT3b的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),r=-0.059。2.Western-blotting示5-aza-CdR處理后,DNMT3b蛋白表達(dá)水平降低,而PDCD4表達(dá)水平升高

6、,濃度之間有差異。3.MSP示5-aza-CdR處理前,PDCD4啟動(dòng)子區(qū)域處于高甲基化狀態(tài),而用5-aza-CdR處理后,發(fā)生了去甲基化。
　　四、結(jié)論：1.PDCD4在肝癌組織中表達(dá)降低,DNMT3b在肝癌組織中表達(dá)增高,兩者呈負(fù)相關(guān)。2.甲基化酶抑制劑5-aza-CdR可以抑制DNMT3b在肝癌中的表達(dá),且隨著濃度的增高,抑制作用增強(qiáng);5-aza-CdR通過抑制DNMT3b表達(dá)導(dǎo)致抑癌基因PDCD4表達(dá)水平增高。3.DNMT