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1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
子宮內(nèi)膜異位癥是指子宮內(nèi)膜上的腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)在除子宮腔以外的其他部位,例如盆腔、腎上腺、肺,甚至是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。它是一種臨床常見(jiàn)的依賴(lài)雌激素的婦科疾病,發(fā)病率約為10%-15%,常見(jiàn)于育齡期女性。子宮內(nèi)膜異位癥主要發(fā)生在卵巢(96.4%),其次是軟組織(2.8%)、胃腸道(0.3%)還有泌尿道(0.2%)。子宮內(nèi)膜異位癥的臨床癥狀主要表現(xiàn)為慢性盆腔痛,發(fā)生在大約50%病人,特別是在月經(jīng)期。另外,還會(huì)導(dǎo)致不
2、孕,發(fā)生率為30%-50%。
盡管子宮內(nèi)膜異位癥是一種良性疾病,但它卻有類(lèi)似于惡性腫瘤的惡性生物學(xué)行為,如遷移、侵襲以及非限制性惡性增殖?,F(xiàn)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制與上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程有關(guān),據(jù)報(bào)道大約有10%-15%的子宮內(nèi)膜異位癥患者的內(nèi)膜組織具有更強(qiáng)的侵襲力,極易侵入到相關(guān)的組織及器官上,從而產(chǎn)生一系列嚴(yán)重的臨床癥狀,而且深部浸潤(rùn)型的子宮內(nèi)膜異位癥患者對(duì)激素的抵抗治療效果不佳?,F(xiàn)在被大家廣為接受的子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)
3、制是“經(jīng)血逆流學(xué)說(shuō)”,但幾乎所有的育齡期女性在月經(jīng)時(shí)期都會(huì)有經(jīng)血逆流的現(xiàn)象,而發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率只有10%-15%左右。隨著越來(lái)越多的研究,我國(guó)郎景和教授又提出了“在位內(nèi)膜決定論”的假說(shuō),即由于子宮內(nèi)膜上某些基因的變化引起了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。但是子宮內(nèi)膜異位癥的在位內(nèi)膜的細(xì)胞和分子方面的特性尚未完全闡明,需要進(jìn)一步的研究,為子宮內(nèi)膜異位癥尋找有效的治療方法。
PDCD4最初是作為一個(gè)促凋亡因子被發(fā)現(xiàn)的,隨著后來(lái)的研
4、究發(fā)現(xiàn)PDCD4還可以通過(guò)抑制某些蛋白翻譯和基因轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮抗腫瘤抑制作用。據(jù)報(bào)道在多種惡性腫瘤中PDCD4的mRNA和蛋白水平都是明顯下調(diào)的,例如肝癌、膠質(zhì)瘤、肺癌、胃癌和卵巢癌。PDCD4的過(guò)表達(dá)可以明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、周期阻滯、增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲及血管形成作用。另外,PDCD4還可作為炎性因子參與肥胖、脂肪組織炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、LPS/D-GalN誘導(dǎo)肝損傷的發(fā)生。鑒于PDCD4在腫瘤及炎癥中
5、的作用,我們推測(cè)PDCD4在子宮內(nèi)膜異位癥中發(fā)揮著一定的作用。
在本研究中,我們檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜以及對(duì)照子宮內(nèi)膜中PDCD4的表達(dá),利用體外實(shí)驗(yàn)研究PDCD4過(guò)表達(dá)或干擾后對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞HEC-1-A和Ishikawa增殖、遷移及侵襲的影響及其機(jī)制,同時(shí)在原代子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。
本實(shí)驗(yàn)的研究目的是探究PDCD4對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的作用,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)一步探討。通過(guò)本研究有利
6、于解釋子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法:
1.PDCD4在對(duì)照組子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達(dá)
收集35例對(duì)照組子宮內(nèi)膜(control)及26例卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥(EM)患者的在位及異位子宮內(nèi)膜,利用qRT-PCR、western blot及免疫組化檢測(cè)對(duì)照組子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位及異位子宮內(nèi)膜中PDCD4 mRNA及蛋白表達(dá)水平。
7、2.雌二醇、孕酮對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞中PDCD4表達(dá)水平的影響
利用不同濃度的雌二醇(0.1nM、1nM、10nM、100nM和1000nM)刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞HEC-1-A和Ishikawa,然后檢測(cè)PDCD4表達(dá)水平。利用不同濃度的孕酮(0.01uM、0.1uM、1uM、10uM和20uM)刺激HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞,48h后收集蛋白,然后檢測(cè)PDCD4表達(dá)變化。然后,用10uM的孕酮刺激HEC-1-A和Ishika
8、wa細(xì)胞不同的時(shí)間點(diǎn)(6h,12h,24h,36h,48h),檢測(cè)PDCD4表達(dá)水平的變化。
3.PDCD4對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的影響
我們首先在RNA水平和蛋白水平檢測(cè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)PDCD4在Ishikawa細(xì)胞中相對(duì)高表達(dá),在HEC-1-A細(xì)胞中低表達(dá)。利用PDCD4過(guò)表達(dá)載體(pEGFP-C1-PDCD4)轉(zhuǎn)染HEC-1-A和Ishik
9、awa細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后利用CCK8試劑盒、克隆形成及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDCD4對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響,在Ishikawa細(xì)胞中用兩種siRNA轉(zhuǎn)染干擾PDCD4以后對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的的影響。
4.PDCD4在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響
利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞(過(guò)表達(dá)或干擾PDCD4)48h后對(duì)細(xì)胞周期的影響及轉(zhuǎn)染24h對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。
10、5.PDCD4對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞自噬水平的影響
利用western blot方法分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)HEC-1-A細(xì)胞24h后的蛋白和干擾Ishikawa細(xì)胞48h后的蛋白中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B的表達(dá)變化。
6.PDCD4抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)機(jī)制
利用PDCD4過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞,或利用特異性針對(duì)PDCD4的兩種siRNA轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后分別收蛋白,利用
11、westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-P65、MMP2和MMP9的表達(dá)情況,探討PDCD4對(duì)遷移及侵襲作用的機(jī)制。
7.PDCD4對(duì)原代子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移的作用及其機(jī)制
分離培養(yǎng)處于分泌期子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)腺上皮細(xì)胞標(biāo)志物(角蛋白)及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(波形蛋白)的表達(dá)鑒別細(xì)胞類(lèi)別,用CCK8試劑盒檢測(cè)PDCD4對(duì)原代腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞增殖能力的影響。然后又利用Tran
12、swell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDCD4對(duì)原代腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞遷移的影響。進(jìn)一步利用western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在原代腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PDCD4或干擾PDCD4后p-P65、MMP2和MMP9的表達(dá)情況,探討PDCD4抑制細(xì)胞遷移的機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1.在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中PDCD4表達(dá)明顯降低
利用qRT-PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮
13、內(nèi)膜中PDCD4的表達(dá)低于對(duì)照子宮內(nèi)膜。免疫組化的結(jié)果顯示PDCD4表達(dá)主要位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿中,而在間質(zhì)細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。與對(duì)照組子宮內(nèi)膜相比,子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中PDCD4的表達(dá)明顯降低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組子宮內(nèi)膜中位于增生期的內(nèi)膜PDCD4表達(dá)明顯高于分泌期的內(nèi)膜,另外,與對(duì)照組處于增生期的子宮內(nèi)膜相比,子宮內(nèi)膜異位癥患者增生期的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中PDCD4的表達(dá)明顯降低。
2.孕酮在子宮內(nèi)膜細(xì)
14、胞中可以下調(diào)PDCD4表達(dá),雌二醇對(duì)PDCD4的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響
分別用不同濃度的孕酮、雌二醇刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后收集蛋白,發(fā)現(xiàn)孕酮能夠明顯下調(diào)子宮內(nèi)膜細(xì)胞PDCD4蛋白的表達(dá),但雌二醇對(duì)PDCD4的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響;利用濃度10uM的孕酮分別刺激細(xì)胞不同的時(shí)間也可以明顯下調(diào)PDCD4蛋白的表達(dá)。
3.PDCD4抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖及克隆形成能力
利用PDCD4過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEC-1-A和Ishi
15、kawa細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后檢測(cè)PDCD4對(duì)細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PDCD4過(guò)表達(dá)載體后可明顯抑制細(xì)胞增殖能力,在Ishikawa細(xì)胞中用兩種siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞干擾PDCD4以后結(jié)果顯示PDCD4 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力明顯高于對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組。利用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDCD4對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響,結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)PDCD4后可明顯抑制HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞的克隆形成能力,在Ishikawa細(xì)胞中用兩種siRNA
16、轉(zhuǎn)染干擾PDCD4以后細(xì)胞的克隆形成能力明顯上調(diào)。
4.PDCD4在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞周期及凋亡沒(méi)有明顯的作用
利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PDCD4對(duì)細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示無(wú)論過(guò)表達(dá)或干擾PDCD4對(duì)細(xì)胞周期都沒(méi)有明顯的影響。同時(shí)也利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PDCD4對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示無(wú)論過(guò)表達(dá)或干擾PDCD4對(duì)細(xì)胞凋亡都沒(méi)有明顯的影響。
5.PDCD4能夠抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的自噬水平
利用PDCD4過(guò)
17、表達(dá)載體或siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后收蛋白,結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)PDCD4后,LC3B表達(dá)水平明顯降低;下調(diào)細(xì)胞PDCD4后,LC3B表達(dá)水平明顯升高。
6.PDCD4可以抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲作用
利用PDCD4過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后做Transwell實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染PDCD4過(guò)表達(dá)載體的Ishikawa細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)明顯低于空載體轉(zhuǎn)染組,在HEC-1-A細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。利用特異性
18、針對(duì)PDCD4的兩種siRNA轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞,結(jié)果顯示PDCD4 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中遷移的細(xì)胞數(shù)目明顯的多于對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組。同時(shí)利用Transwell實(shí)驗(yàn)(鋪基質(zhì)膠)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PDCD4后對(duì)細(xì)胞侵襲的影響,結(jié)果顯示PDCD4過(guò)表達(dá)后可明顯抑制HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞的侵襲能力,干擾PDCD4后則明顯的促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的侵襲能力。
7.PDCD4通過(guò)抑制NF-κB/MMP2/MMP9通路抑
19、制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲
利用western blot實(shí)驗(yàn)探討PDCD4抑制遷移及侵襲的機(jī)制,結(jié)果顯示在HEC-1-A細(xì)胞過(guò)表達(dá)PDCD4以后,p-P65、MMP2和MMP9的表達(dá)明顯的降低。對(duì)Ishikawa細(xì)胞干擾PDCD4以后發(fā)現(xiàn)p-P65、MMP2和MMP9的表達(dá)明顯的升高。
8.PDCD4抑制原代子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的遷移和增殖
為了進(jìn)一步的驗(yàn)證PDCD4在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用,分離培
20、養(yǎng)正常的位于分泌期的子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。用CCK8試劑盒檢測(cè)PDCD4對(duì)原代腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示在原代細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PDCD4后明顯抑制細(xì)胞的增殖,干擾PDCD4后明顯的促進(jìn)細(xì)胞的增殖。然后又利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDCD4對(duì)原代腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞遷移作用的影響,結(jié)果顯示在原代細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PDCD4后明顯抑制細(xì)胞的遷移,干擾PDCD4后明顯的促進(jìn)細(xì)胞的遷移。
9.PDCD4通過(guò)抑制N
21、F-κB/MMP2/MMP9通路抑制原代子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的遷移
進(jìn)一步利用western blot實(shí)驗(yàn)探討在原代腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中PDCD4抑制遷移的機(jī)制,結(jié)果顯示在原代細(xì)胞過(guò)表達(dá)PDCD4以后,p-P65、MMP2和MMP9的表達(dá)明顯的降低。在原代細(xì)胞中干擾PDCD4以后發(fā)現(xiàn)p-P65、MMP2和MMP9的表達(dá)明顯的升高。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
1.PDCD4在對(duì)照子宮內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于子宮內(nèi)膜異位
22、癥患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的表達(dá)。
2.孕酮可以下調(diào)子宮內(nèi)膜細(xì)胞中PDCD4表達(dá)水平,雌二醇對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)沒(méi)有明顯的作用。
3.PDCD4能夠明顯抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖及克隆形成能力,但對(duì)細(xì)胞周期及凋亡沒(méi)有明顯的作用。
4.PDCD4可以抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的自噬水平。
5.PDCD4可以通過(guò)NF-κB/MMP2/MMP9通路抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲作用。
6.PDC
23、D4可以抑制原代子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的遷移和增殖,抑制遷移的機(jī)制與NF-κB/MMP2/MMP9通路有關(guān)。
創(chuàng)新性及意義:
1.首次探討了PDCD4與子宮內(nèi)膜異位癥之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)PDCD4在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達(dá)明顯降低。
2.在體外,PDCD4可以明顯抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、克隆形成能力、遷移及侵襲作用。
3.我們的研究發(fā)現(xiàn)可能為子宮內(nèi)膜異位癥的治療提供一個(gè)新的治
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