AnnexinⅠ在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用及機制研究.pdf

1、目的： 子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥，Endometriosis，EMS)累及10-15％的育齡婦女，且發(fā)病率呈上升趨勢，雖然是良性病變，但其病理過程表現(xiàn)出浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性病的特征。目前有關內(nèi)異癥發(fā)生的分子機制尚不清楚。 研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)在位內(nèi)膜基因/蛋白表達譜的改變可能是內(nèi)異癥發(fā)生的遺傳學基礎，這些改變直接影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程，影響逆流經(jīng)血中的內(nèi)膜碎片的粘附、侵襲和異位生

2、長。在前期工作中，通過比較EMS在位內(nèi)膜與正常的子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)組學的變化情況，我們發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白家族成員AnnexinⅠ蛋白為差異表達明顯的基因，提示其可能與內(nèi)異癥的發(fā)生相關，但其具體作用機制尚不清楚。 AnnexinⅠ是一種Ca2+依賴性的膜聯(lián)蛋白，定位在細胞漿，或是以鈣依賴的方式與細胞膜或者細胞骨架相連，在細胞信號轉(zhuǎn)導、DNA復制、細胞分化、粘附、凋亡及鈣離子通道的形成等諸多生命活動中發(fā)揮重要的作用。AnnexinⅠ為受體酪氨

3、酸激酶的底物，對磷脂酶A2(PLA2)具有抑制作用，進而對前列腺素的代謝具有負調(diào)控的作用。研究發(fā)現(xiàn)AnnexinⅠ可以和多種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，如S100家族成員、F-肌動蛋白、胞漿磷脂酶A2、表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)以及α4β1整合素等。AnnexinⅠ存在多個潛在的磷酸化位點，可以作為EGFR酪氨酸激酶的磷酸化底物，特異性的調(diào)節(jié)有絲分裂激活的蛋白激酶(Mitog

4、en-activated protein kinases，MAPK)信號轉(zhuǎn)導通路，參與細胞的生命活動。 在惡性腫瘤疾病中發(fā)現(xiàn)AnnexinⅠ的表達水平出現(xiàn)多樣化的情況，并且發(fā)現(xiàn)其與腫瘤細胞的分化程度有關。在婦科疾病中發(fā)現(xiàn)AnnexinⅠ在子宮內(nèi)膜非典型增生中高表達，在子宮內(nèi)膜腺癌組織中表達減低。研究表明子宮內(nèi)膜異位癥具有侵襲和轉(zhuǎn)移等某些惡性疾病的病理特征，其病理改變以及臨床表現(xiàn)上都與腫瘤疾病有著相似之處。這些研究結(jié)果提示我們可以

5、從研究腫瘤細胞的生物學角度去觀察子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜細胞功能的變化情況，并以此為研究方向來探討其分子病理的情況。 本研究擬首先觀察AnnexinⅠ在臨床EMS病人中的表達情況，同時參照文獻報道的方法在體外分離和培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞，在這些工作的基礎上采用體外實驗進一步探討AnnexinⅠ在子宮內(nèi)膜異位癥中的具體作用機制。 方法： 一、臨床資料的收集及觀察AnnexinⅠ的表達情況 1、選擇2005年

6、6月至2006年6月，因子宮內(nèi)膜異位癥在中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)開腹手術或腹腔鏡手術行子宮切除術的病例組織，選擇同期因?qū)m頸病變CINⅢ行子宮切除的患者的子宮內(nèi)膜組織為對照(對照組)。 2、免疫組織化學方法檢測AnnexinⅠ在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達情況。 3、免疫熒光化學方法檢測AnnexinⅠ在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達情況。 4、實時定量PCR(Real-timePCR)方法檢測AnnexinⅠ在子宮

7、內(nèi)膜異位癥組織中的表達情況。 5、westernblot方法檢測AnnexinⅠ在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達情況。 二、體外分離及培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜細胞 1、收集標本。 2、用膠原酶消化，篩網(wǎng)濾過的方法分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和基質(zhì)細胞。 3、倒置光學顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)、貼壁狀態(tài)。 4、利用免疫細胞化學方法鑒定培養(yǎng)細胞的純度。 5、利用免疫熒光技術鑒定培養(yǎng)細胞的純度。

8、6、利用免疫細胞化學方法檢測AnnexinⅠ的表達情況。 7、三重免疫熒光的方法檢測AnnexinⅠ在子宮內(nèi)膜腺上皮細胞中的分布情況。 三、AnnexinⅠ在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用機制 1、收集臨床新鮮子宮內(nèi)膜標本。 2、用含有EGF的培養(yǎng)液培養(yǎng)正常人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞及內(nèi)異癥在位內(nèi)膜腺上皮細胞。 3、倒置光學顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)、貼壁狀態(tài)。 4、細胞粘附試驗觀察細胞在底物上的粘附能力。

9、 5、westernblot方法檢測EGF作用后兩種內(nèi)膜腺上皮細胞中細胞粘附分子α4β1integrin和AnnexinⅠ的表達情況。 6、三重免疫熒光技術檢測AnnexinⅠ與細胞粘附分子α4β1integrin在正常內(nèi)膜腺上皮細胞中的共分布情況。 7、免疫共沉淀方法檢測AnnexinⅠ與細胞粘附分子α4β1integrin在正常內(nèi)膜腺上皮細胞中相互作用情況。 8、免疫共沉淀方法檢測EGF作用后兩種內(nèi)膜

10、腺上皮細胞中AnnexinⅠ與細胞粘附分子α4β1integrin相互作用情況。 9、免疫沉淀方法檢測EGF作用后異位癥內(nèi)膜腺上皮細胞中AnnexinⅠ酪氨酸磷酸化水平。 結(jié)果： 1、收集因子宮內(nèi)膜異位癥經(jīng)開腹手術或腹腔鏡手術行子宮切除術的患者35例，選擇同期因?qū)m頸病變CINⅢ行子宮切除的10例患者的子宮內(nèi)膜組織為對照(對照組)。 2、Real-timePCR結(jié)果顯示內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織中AnnexinⅠm

11、RNA表達水平(0.0045±0.0019)低于正常內(nèi)膜組織(0.014±0.005)2.1倍，二者比較有統(tǒng)計學差異(t=2.35,P＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織蛋白水平(0.44±0.16)低于正常內(nèi)膜組織(0.15±0.04)1.9倍。二者比較有統(tǒng)計學差異(t=2.92,P＜0.05)。 3、免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示AnnexinⅠ在正常內(nèi)膜組織和內(nèi)異癥內(nèi)膜組織中的分布一致，主要分布在子宮

12、內(nèi)膜腺體區(qū)腺細胞膜的周圍，免疫組化的結(jié)果進行定量分析發(fā)現(xiàn)AnnexinⅠ在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜組織表達水平(10.34±0.76)低于正常內(nèi)膜組織(20.47±1.9)(t=5.95,P＜0.05)。 4、在體外成功分離和培養(yǎng)了人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和基質(zhì)細胞，經(jīng)免疫細胞化學和免疫熒光染色技術鑒定細胞純度可達95％。 5、免疫細胞化學結(jié)果顯示AnnexinⅠ主要分布在正常子宮內(nèi)膜腺細胞的細胞膜周，并且在內(nèi)異癥的在位內(nèi)膜腺細胞中表

13、達明顯減少。雙重免疫熒光結(jié)果表明AnnexinⅠ與腺上皮細胞標志分子cytokeratin共同分布在細胞膜的周圍。 6、加入EGF后異位癥的在位內(nèi)膜腺上皮細胞的粘附力較正常的內(nèi)膜腺上皮細胞明顯升高。 7、EGF處理前后，在正常子宮內(nèi)膜腺上皮和異位癥內(nèi)膜腺上皮中，α4β1integrin的表達沒有明顯的改變，AnnexinⅠ的表達不僅在異位內(nèi)膜腺上皮中表達下降，而且EGF可以使腺上皮中AnnexinⅠ的表達水平下降。

14、 8、在正常的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞中AnnexinⅠ與細胞粘附分子α4β1integrin相互作用可能介導細胞的生物功能。 9、EGF不影響正常的子宮內(nèi)膜腺細胞中與AnnexinⅠ結(jié)合的α4β1integrin的數(shù)量，而在異位內(nèi)膜的腺上皮細胞中與AnnexinⅠ結(jié)合的α4β1integrin的數(shù)量明顯減少，而且在EGF處理后的異位內(nèi)膜腺細胞中，與AnnexinⅠ結(jié)合的α4β1integrin較EGF作用前減少。 10、E

15、GF可以明顯增加內(nèi)異癥在位內(nèi)膜腺上皮細胞中AnnexinⅠ的磷酸化水平。 結(jié)論： 1、在臨床資料中發(fā)現(xiàn)AnnexinⅠ在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜組織中表達水平下降，印證了子宮內(nèi)膜異位癥的“源頭學說——在位內(nèi)膜決定論”。 2、通過改良的方法，在體外成功的分離和培養(yǎng)了人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和基質(zhì)細胞，建立了研究子宮內(nèi)膜異位癥的體外研究模型。 3、觀察到AnnexinⅠ在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜組織腺上皮細胞中表達下