轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子DNMT3b在肝癌細(xì)胞SMMC7721中的作用.pdf

1、肝癌是人體常見的致命性腫瘤，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類的健康，因此深入研究肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，進(jìn)而加強(qiáng)肝癌的防治具有重要意義。 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，已逐漸認(rèn)識(shí)到表遺傳學(xué)(Epigenetics)調(diào)節(jié)與腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)：因?yàn)檫@種表遺傳學(xué)調(diào)節(jié)不改變基因編碼序列，并且是可逆的，因而越來越受到重視。研究表明，表遺傳學(xué)或/和遺傳學(xué)改變均可引起腫瘤的發(fā)生是一個(gè)涉及多種腫瘤基因功能改變的多步驟過程，其中腫瘤抑制基因的功能失活為細(xì)胞的惡性

2、轉(zhuǎn)化所必需。由DNMTs催化完成的DNA甲基化是DNA的一種天然修飾方式，是表遺傳學(xué)主要內(nèi)容之一，其在基因的表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)、基因組印記、X染色體失活及腫瘤的發(fā)生等許多方面發(fā)揮著重要的作用。 在DNMTs家族中，DNMT3b的作用最為重要。DNMT3b主要表達(dá)于未分化的胚胎干細(xì)胞，催化DNA的從頭甲基化，在正常體細(xì)胞中表達(dá)很低。CPG島是公認(rèn)的基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域。大約50﹪的CPG島位于基因啟動(dòng)子區(qū)域。在正常細(xì)胞大部分的啟動(dòng)

3、子區(qū)域CPG島是未甲基化的。由DNMT3b催化的腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)CPG島的甲基化反應(yīng)，使CPG島甲基化狀態(tài)改變導(dǎo)致該基因表達(dá)沉默，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，F(xiàn)HIT基因(一重要的腫瘤抑制基因)的表達(dá)明顯受抑制，用siRNA抑制DNMT3b表達(dá)后，F(xiàn)HJIT基因又恢復(fù)表達(dá)，但這一過程中，F(xiàn)HIT基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島并未被甲基化，由此提示在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中DNMT3b除發(fā)揮DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用外

4、尚有轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用。事實(shí)上，DNMT3b具有PWWP和PHD結(jié)構(gòu)域，而這些結(jié)構(gòu)域與蛋白質(zhì)．蛋白質(zhì)間的相互作用有關(guān)，說明DNMT3b已經(jīng)具備了作為信號(hào)傳導(dǎo)分子的基礎(chǔ)。以前的研究多集中于DNMT3b作為酶的功能，而其作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能目前尚未見報(bào)道。 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Signal transducers and activators of transcription，STATs)是一重要的核轉(zhuǎn)錄因子．STATs家族成

5、員參與了許多細(xì)胞因子、生長因子的信號(hào)傳導(dǎo)，在調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的生長、分化、凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演進(jìn)有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，STATs及其下游基因Bcl-2、CyclinD1．c-myc、VEGF、P21等在肝癌組織中異常表達(dá)，而STATs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)不變。有研究表明：STATs及其下游基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。如：Bcl-2、CydinDl．、c-my

6、c、VEGF都是重要的癌基因。它們?cè)诟渭?xì)胞肝癌的發(fā)生、增殖、分化、凋亡、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等多方面都發(fā)揮了重要作用。如果能夠證實(shí)DNMT3b與STATs信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)聯(lián)，則提示DNMT3b-STATs信號(hào)傳導(dǎo)通路的存在，這就說明DNMT3b即可以作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化基因的甲基化，影響基因的表達(dá)，又可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮作用。這就進(jìn)一步揭示了DNMT3b功能的多樣性，為腫瘤的基因治療提供新的靶點(diǎn)，為肝癌的防治提供新思路。

7、方法 1、傳代培養(yǎng)SMMC7721細(xì)胞； 2、將終濃度為50IlM的DNMT3bsiRNA轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞SMMC7721中： 3、在SMMC7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNM'IBbsiRNA 48h后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取細(xì)胞質(zhì)蛋白或總蛋白，用Western blotting檢測DNMT3b的表達(dá)改變； 4、在SMMC721細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNMT3bsiRNA前及轉(zhuǎn)染24、48h后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)

8、染細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量； 5、用Westem blotting檢測STATs及其下游基因c-myc，VEGF．，CyclinD1等的表達(dá)改變情況； 6、處理所得數(shù)據(jù)，得出結(jié)論。 結(jié)果 1、在SMMC7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNMT3bsiRNA 48h后，通過Western Blotting檢測DNMT3b的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DNMT3b表達(dá)水平比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯降低。 2、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長速度與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比明

9、顯受到抑制，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)有大量死亡細(xì)胞存在。 3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的STATl、STAT3、STATS及其下游基因VEGF、c-myc、CyclinD1的表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比均降低。 結(jié)論 1、DNMT3bsiRNA的建立可以方便地研究DNMT3b的功能。通過DNMT3bsiRNA特異性的抑制DNMT3b的表達(dá)。 2、在SMMC7721細(xì)胞體系中存在DNMT3b-STATs信號(hào)傳導(dǎo)通路，