甘氨脫氧膽酸鈉誘導(dǎo)肝癌SMMC7721細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、在肝癌中，總膽汁酸(TBA)和甘氨結(jié)合型膽汁酸(GCBA)明顯高于正常組織，在增高的膽汁酸中，以疏水性膽汁酸為主，疏水性膽汁酸對(duì)多種細(xì)胞具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和毒性損傷作用【¨，但對(duì)肝癌細(xì)胞作用機(jī)制還不是很清楚，因此研究疏水性膽汁酸對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制尤為重要。 目的：(1)觀察不同濃度的GDCA對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖與凋亡誘導(dǎo)的影響；(2)探討GDCA誘導(dǎo)肝癌SMMC772l細(xì)胞凋亡機(jī)制。方法：(1)MTr實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GDCA對(duì)

2、肝癌SMMC772l細(xì)胞增殖影響；(2)DNA梯度凝膠電泳檢測(cè)GDCA誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡片斷；(3)FCM檢測(cè)GDCA對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞周期影響；(4)AnnexinV-FITC實(shí)驗(yàn)對(duì)GDCA誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡檢測(cè)；(5)分光光度計(jì)法檢測(cè)caspase-3／9活性。(6)RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、P21、P27、cyclinDl、E2F1、c-myc、survivinmRNA的表

3、達(dá)影響；(7)免疫組化檢測(cè)突變P53、Bcl-2、cyclinDl、PCNA癌基因的蛋白表達(dá)影響；(8)PCR-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性；(9)RT-PCR檢測(cè)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERTmRNA表達(dá)影響。 結(jié)果：(1)GDCA可明顯抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖，在小劑量時(shí)[200、400umol／L]可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有明顯地時(shí)效和量效關(guān)系。在大劑量[800umol／L]時(shí)可引起細(xì)胞壞死。100umol／L的GDCA可應(yīng)急性

4、短暫地刺激細(xì)胞增殖。(2)DNA梯度凝膠電泳顯示GDCA作用肝癌SMMC7721細(xì)胞后有明顯地細(xì)胞凋亡帶．(3)細(xì)胞周期檢測(cè)顯示GDCA作用SMMC7721細(xì)胞后G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞阻滯于Gl／S期。(4)AnnexinV-FITC檢測(cè)結(jié)果顯示GDCA200、400mol／L處理組48h和72h后細(xì)胞凋亡比例比對(duì)照組明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)GDCA顯著激活caspase-3／9活性。(6)GDCA可抑制Bc

5、l-2mRNA的表達(dá)同時(shí)上調(diào)Bax基因表達(dá)，能抑制細(xì)胞周期相關(guān)的正向調(diào)控因子cyclinDl、E2F1mRNA的表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)控因子P21、P27mRNA的表達(dá)，并可下調(diào)survivin基因的表達(dá)，對(duì)c-myc基因的表達(dá)影響較小。(7)GDCA可抑制突變型P53、Bcl-2、cyclinDl、PCNA癌蛋白表達(dá)。(8)GDCA抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞的端粒酶活性和下調(diào)hTERTmRNA的表達(dá)。 結(jié)論：(1)GDCA

6、能抑制肝癌SMMC772l細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡。其細(xì)胞增殖抑制與細(xì)胞周期G1／S阻滯有關(guān)。(2)GDCA誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡機(jī)理可能與下調(diào)突變P53、Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)有關(guān)。(3)GDCA可通過(guò)抑制細(xì)胞周期正向調(diào)控因子的表達(dá)(cyclinDl)，上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)控因子(P21、P27)的表達(dá)，使細(xì)胞阻滯于G1／S期，抑制了細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(4)GDCA對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)癌基因surviv