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文檔簡介
1、原發(fā)性肝癌(Primary hepatic carcinoma,PHC)是世界流行最廣的惡性腫瘤之一,其在所有癌癥中惡性程度高,治療最困難,惡性發(fā)展速度最快,生存時間最短。2007年全世界的肝癌死亡例數(shù)為680 000,在全球腫瘤死因中位列第三。而我國由于肝炎和肝炎轉(zhuǎn)肝硬化的病人眾多,致使肝癌在我國的發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平。我國每年死于肝癌人數(shù)占全世界肝癌死亡人數(shù)的55%以上,目前尚缺乏有效的治療藥物。因此為降低其發(fā)病率和死亡
2、率,諸多學者長期致力于防治肝癌的研究。
細胞凋亡比例明顯失調(diào)是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要因素,如能誘導腫瘤細胞凋亡,使其凋亡的比例增加,則可能遏制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是綠茶多酚提取物兒茶素(catechin)的主要成分,具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的作用。但是較高濃度的EGCG可直接導致細胞壞死,所以及早發(fā)現(xiàn)細胞的早期凋亡,控制EGCG的
3、劑量,是減少藥物對細胞損傷的最有效的方法。多數(shù)有關EGCG誘導腫瘤細胞凋亡的研究,是依據(jù)流式細胞術(FCM)的凋亡細胞峰(亞G1細胞峰)來做出評價的。然而,亞G1細胞群的出現(xiàn)并非是凋亡細胞的特異變化。因此,本研究建立了一種檢測細胞早期凋亡的新方法-PSAB-VA/EL法,來檢測EGCG誘導人肝癌SMMC-7721細胞早期凋亡的發(fā)生。
同時,運用SELDI-TOF-MS和MALDI-TOF/TOF蛋白質(zhì)譜技術檢測與EGCG誘
4、導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡相關的關鍵蛋白,探討EGCG誘導人肝癌細胞早期凋亡的可能機制。
第—章、PSAB-VA/EL法檢測細胞早期凋亡方法的建立。
目的:建立一種經(jīng)濟實用且特異性高的細胞早期凋亡檢測新方法,并與常用的Annexin V-FITC/PI法比較。
方法:
1、以不同質(zhì)量濃度的EGCG作用Jurkat細胞,采用Annexin V-FITC/PI法檢測Jurkat
5、細胞凋亡率,并以此作為細胞凋亡模型。
2、嘗試用不同的標記有熒光染料的PSAB抗體和核酸熒光染料來檢測此細胞凋亡模型。
結(jié)果:
1、經(jīng)Annexin V-FITC/PI法檢測,Jurkat細胞隨著EGCG濃度的增加,正常細胞比例不斷下降,而晚期凋亡細胞的百分比明顯升高,同時早期凋亡細胞保持在10%左右。
2、對各種標記有熒光染料的PSAB抗體和核酸熒光染料比較后,發(fā)現(xiàn)PSAB-VA
6、和EL搭配使用,能較好地檢測細胞凋亡。
結(jié)論:
1、PSAB-VA/EL法和Annexin V-FITC/PI法在檢測細胞凋亡各個階段的百分比時,其結(jié)果的變化趨勢一致。
2、PSAB-VA/EL法可能是一種比較靈敏的細胞早期凋亡檢測方法。
第二章、EGCG誘導人肝癌SMMC-7721細胞早期凋亡。
目的:探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)誘導人肝癌SMMC-77
7、21細胞早期凋亡的變化規(guī)律。
方法:
1、通過MTT法初步篩選EGCG誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的作用濃度。
2、利用PSAB-VA/EL法(第一章所述),通過流式細胞儀檢測EGCG對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用和早期凋亡的誘導效應。
結(jié)果:EGCG誘導人肝癌SMMC-7721細胞早期凋亡的最佳作用劑量是100mG/L,早期凋亡率達48.16%。隨著EGCG濃度增
8、加(125~175mg/L),早期凋亡率明顯下降,而晚期凋亡細胞的百分比明顯升高。
結(jié)論:EGCG有明顯的誘導人肝癌SMMC-7721細胞早期凋亡的作用,且呈劑量依賴性,小劑量起誘導凋亡作用,而大劑量則對細胞株具有殺傷作用,直接導致細胞壞死。
第三章、EGCG誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡后的相關蛋白變化及鑒定研究。
目的:利用蛋白質(zhì)譜技術檢測與EGCG誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡
9、相關的關鍵蛋白,探討EGCG誘導人肝癌細胞早期凋亡的可能機制。
方法:
1、運用SELDI-TOF-MS技術篩選人肝癌血清和人肝癌SMMC-7721細胞裂解液中共同存在的蛋白。
2、運用SELDI-TOF-MS技術檢測EGCG誘導SMMC-7721細胞凋亡后的細胞裂解液中存在的蛋白。
3、檢測在肝癌血清、SMMC-7721細胞裂解液以及EGCG作用后的SMMC-7721細胞裂解液中
10、,共有的關鍵蛋白。
4、運用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術平臺,并結(jié)合iTRAQ蛋白質(zhì)定量試劑的使用,對上述關鍵蛋白標志物進行鑒定。
結(jié)果:
1、人肝癌血清和人肝癌SMMC-7721細胞裂解液中共同存在的蛋白有23個。
2、SMMC-7721細胞裂解液與EGCG誘導后的SMMC-7721細胞相比,有16個蛋白高表達,16個蛋白低表達。
3、在肝癌血清、SMMC-7
11、721細胞裂解液以及EGCG作用后的SMMC-7721細胞裂解液中,共有的關鍵蛋白為:4283.74 Da和8562.11 Da分子量蛋白,并以此作為EGCG誘導入肝癌SMMC-7721細胞凋亡后的關鍵蛋白標志物。
4、MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術檢測到的肝癌血清中,高表達的標志蛋白α-1-抗胰蛋白酶的酶解片段與關鍵蛋白4283.74 Da的分子量非常接近,而低表達的標志蛋白纖溶酶原的酶解片段與關鍵蛋白8562.11
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