RNAi靶向肝癌細(xì)胞hTERT后H2AX和DNMT3b基因表達(dá)的變化.pdf

1、目的:為進(jìn)一步研究hTERT的新的生物學(xué)功能,探索肝癌基因治療的新途徑與新方法,本研究采用RNA干擾技術(shù),以SMMC-7721細(xì)胞為研究對(duì)象,將hTERT mRNA為作用靶標(biāo),在體外細(xì)胞水平下調(diào)hTERT的表達(dá)后,觀察肝癌細(xì)胞一般生物學(xué)特性的改變以及抑癌基因H2AX和甲基化轉(zhuǎn)移酶hDNMT3b表達(dá)的改變。
　　方法:利用PCR技術(shù)克隆U6啟動(dòng)子,構(gòu)建RNAi表達(dá)空載體pGFP-U。將hTERT cDNA序列(AGACCAAGCAC

2、TTCCTCTACT,AF015950:980-1000bp)及其反向重復(fù)序列以9bp連接序列連接后再加上RNA聚合酶Ⅲ的終止序列(TTTTTT),將此段DNA序列克隆至pGFP-U載體的U6啟動(dòng)子下游,構(gòu)建重組載體pGFP-shTERT,該目的載體可以在體內(nèi)表達(dá)靶向hTERT的短發(fā)卡RNA。將重組質(zhì)粒與對(duì)照質(zhì)粒pGFP-U分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后,倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,并以G418篩選抗性轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以MTT實(shí)驗(yàn)

3、測(cè)定SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)速度;以TRIzol試劑分別提取各組細(xì)胞總RNA,并以各組總RNA為模板進(jìn)行兩步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),檢測(cè)分析hTERT、H2AX、DNMT3b基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:RNAi空載體pGFP-U和RNAi重組載體pGFP-shTERT經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證。在兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均能觀察到綠色熒光蛋白的高效表達(dá)。與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pGFP-U的SMMC-7721細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染表達(dá)shRNA重組質(zhì)粒的

4、細(xì)胞其hTERT基因表達(dá)水平顯著下降,細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢,H2AX基因表達(dá)水平顯著提高,而DNMT3b沒(méi)有明顯改變。
　　結(jié)論:1.成功構(gòu)建RNAi空載體pGFP-U和靶向hTERT的重組載體pGFP-shTERT,并獲得穩(wěn)定表達(dá)靶向hTERT的shRNA的SMMC-7721肝癌細(xì)胞株。
　　2.SMMC-7721細(xì)胞hTERT下調(diào)后,明顯抑制細(xì)胞的增殖能力。同時(shí),hTERT可與H2AX發(fā)生作用,對(duì)H2AX的表達(dá)有一定調(diào)節(jié)作用