2-乙酰氨基芴誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)的形成.pdf

1、芳香胺類化合物2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene，2-AAF或AAF)是一種研究致突變劑和致癌物代謝活化的工具藥，廣泛運(yùn)用于致突變致癌機(jī)制研究中。它作為間接遺傳毒物可被細(xì)胞色素P450家族(特別是CYP1A1/1A2)N-羥化為N-OH-AAF，然后與鳥苷酸C8的親核集團(tuán)形成dG-C8-AAF、dG-C8-AF和dG-N2-AAF等DNA加合物，進(jìn)而引起移碼突變、錯(cuò)配等。除了與DNA形成加合物外，2-AAF還可誘

2、導(dǎo)DNA單鏈斷裂(singlestrandbreaks，SSB)、雙鏈斷裂(doublestrandsbreaks，DSBs)、鏈內(nèi)、鏈間交聯(lián)等DNA損傷，其中DSBs是最嚴(yán)重的DNA損傷。 以往DSBs檢測方法脈沖電場凝膠電泳(pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE)、彗星實(shí)驗(yàn)以及DNA洗脫實(shí)驗(yàn)，雖然可以量化DSBs，但檢測效率比較低。近年來，γH2AX(gamma-H2AX，即磷酸化的H2AX)

3、被認(rèn)為可以靈敏、有效地檢測DSBs。電離輻射(ionizingradiation，IR)誘導(dǎo)的DSBs導(dǎo)致組蛋白H2AX迅速發(fā)生磷酸化，大量磷酸化的H2AX募集其他DNA損傷修復(fù)蛋白到DSBs位點(diǎn)形成焦點(diǎn)復(fù)合物，并且γH2AX的數(shù)量和DSBs數(shù)量存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。另外，γH2AX焦點(diǎn)的形成與消失這一過程與DSBs的形成與修復(fù)密切相關(guān)。這些都提示γH2AX是一種靈敏檢測DSBs的指示劑。在IR誘導(dǎo)的γH2AX形成的過程中，磷脂酰肌醇3-激

4、酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)樣家族成員參與了H2AX的磷酸化。本實(shí)驗(yàn)室曾用直接遺傳毒物單功能烷化劑N-甲基-N-亞硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)處理FL和CHL細(xì)胞后，觀察MNNG對(duì)γH2AX焦點(diǎn)形成的影響，發(fā)現(xiàn)MNNG誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)形成具有時(shí)間、劑量效應(yīng)。并且用彗星實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了以上結(jié)果。同時(shí)還用PI3K樣家族成員抑制劑渥曼青霉素(

5、wortmannin)與MNNG共同處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)渥曼青霉素可抑制MNNG誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)形成，這說明PI3K樣家族成員參與了γH2AX焦點(diǎn)形成。 為了進(jìn)一步研究γH2AX是否可作為檢測DNA損傷的優(yōu)良指標(biāo)，本研究通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察了2-AAF處理CHL與FL細(xì)胞后，γH2AX焦點(diǎn)形成與2-AAF之間的關(guān)系。隨后，我們用中性彗星驗(yàn)證以上結(jié)果，并比較了γH2AX焦點(diǎn)與中性彗星實(shí)驗(yàn)衡量DNA損傷程度的敏感性的大小。最后，我們也用

6、了渥曼青霉素，驗(yàn)證它是否可以抑制2-AAF誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)形成。 2-AAF的細(xì)胞毒性作用具有時(shí)間、劑量效應(yīng)：用2-AAF(0.1，1，5，10，20，50和100mg·L-1)處理CHL及FL細(xì)胞2，8和24h后，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)測定2-AAF對(duì)兩種細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。對(duì)照組用相同體積的溶劑二甲基亞楓(DimethylSulfoxide，DMSO)處理細(xì)胞。結(jié)果顯示，2-AAF對(duì)CHL、FL細(xì)胞生存率的抑制作用具有時(shí)間、劑量效

7、應(yīng)。相對(duì)較高濃度(5，10，20，50和100mg·L-1)的2-AAF對(duì)CHL細(xì)胞的毒性作用隨時(shí)間的延長明顯增強(qiáng)。低濃度的2-AAF(0.1及1mg·L-1)則沒有明顯的細(xì)胞毒作用。2-AAF對(duì)FL細(xì)胞的毒性作用較小，只有50和100mg·L-12-AAF的細(xì)胞毒性作用較強(qiáng)。 2-AAF誘導(dǎo)CHL細(xì)胞的γH2AX焦點(diǎn)形成具有時(shí)間、劑量效應(yīng)：我們用2-AAF(0.1，1，5和20mg·L-1)處理CHL和FL細(xì)胞10min，2，

8、8和24h后，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察2-AAF對(duì)γH2AX形成的影響。對(duì)照組用相同體積的溶劑DMSO處理細(xì)胞。10min時(shí)大部分空白組，對(duì)照組，0.1，1及5mg·L-12-AAF處理組的CHL細(xì)胞無γH2AX焦點(diǎn)形成，但20mg·L-12-AAF處理組中無論出現(xiàn)γH2AX焦點(diǎn)的細(xì)胞比例還是單個(gè)細(xì)胞內(nèi)γH2AX焦點(diǎn)的數(shù)量都明顯增加；2h時(shí)20mg·L-12-AAF處理組γH2AX焦點(diǎn)的變化更加明顯，而其他濃度的2-AAF處理組對(duì)γH2AX

9、焦點(diǎn)仍然沒有顯著影響；8h時(shí)各濃度2-AAF處理組內(nèi)γH2AX焦點(diǎn)形成都呈現(xiàn)顯著增加趨勢，此時(shí)0.1，1，5和20mg·L-12-AAF處理組中，γH2AX焦點(diǎn)數(shù)量大于20個(gè)的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比分別為4.6％，5.6％，8.0％，37.4％；但是在處理24h后，所有2-AAF處理組中γH2AX焦點(diǎn)數(shù)量及含有γH2AX焦點(diǎn)的細(xì)胞比例都回復(fù)到接近對(duì)照組的水平。然而，2-AAF處理FL細(xì)胞后，細(xì)胞核內(nèi)γH2AX焦點(diǎn)數(shù)量以及含γH2AX焦點(diǎn)的

10、細(xì)胞數(shù)量無明顯改變。 中性彗星實(shí)驗(yàn)證明2-AAF可引起DNA雙鏈斷裂：2-AAF(0.1，1，5和20mg·L-1)處理CHL和FL細(xì)胞10min，2，8和24h后，用中性彗星實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證2-AAF是否可引起DNA雙鏈斷裂。對(duì)照組用相同體積的溶劑DMSO處理細(xì)胞。在整個(gè)時(shí)間段內(nèi)，在0.1，1和5mg·L-12-AAF處理組中，有彗尾細(xì)胞數(shù)量和彗尾長度與對(duì)照組無顯著差別。然而20mg·L-12-AAF處理組在8h時(shí)彗尾長度明顯增加，

11、有彗尾的細(xì)胞占總細(xì)胞百分比也增為84.0％。24h時(shí)這兩項(xiàng)指標(biāo)都有下降。同時(shí)，中性彗星實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證2-AAF不能導(dǎo)致FL細(xì)胞的彗尾增長以及有彗尾細(xì)胞數(shù)量增加。 Wortmannin抑制了2-AAF誘導(dǎo)CHL細(xì)胞的γH2AX焦點(diǎn)形成：我們用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測Wortmannin和2-AAF共同處理CHL細(xì)胞后，PI3K樣家族和H2AX磷酸化的關(guān)系。經(jīng)過與Wortmannin共孵育后，2-AAF誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)形成的能力與只用2-AA

12、F處理相比明顯降低，因此Wortmannin能抑制2-AAF誘導(dǎo)的γH2AX焦點(diǎn)的形成。 結(jié)論：1.2-AAF可誘導(dǎo)CHL細(xì)胞中的γH2AX焦點(diǎn)的形成，并且2-AAF對(duì)γH2AX焦點(diǎn)形成的影響具有時(shí)間、劑量效應(yīng)。 2.10min時(shí)，20mg·L-12-AAF已誘導(dǎo)CHL細(xì)胞中的γH2AX焦點(diǎn)的形成，而中性彗星實(shí)驗(yàn)只有在8h時(shí)才出現(xiàn)彗尾增長；另外，各種濃度(20mg·L-1除外)2-AAF處理時(shí)可使γH2AX焦點(diǎn)數(shù)量增加，