DNA復(fù)制壓力和活性氧誘發(fā)γ-H2AX陽(yáng)性微核及其機(jī)制研究.pdf

1、微核是指位于細(xì)胞漿中，獨(dú)立于細(xì)胞主核之外的圓形或者橢圓形的微小核。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為微核的形成原因是細(xì)胞的染色體受到損傷發(fā)生斷裂或者牽引染色體的紡錘絲出現(xiàn)故障，導(dǎo)致細(xì)胞在進(jìn)入下一次有絲分裂時(shí)，染色體片段或者整條染色體不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞，即微核主要形成于有絲分裂后期。但是目前有多篇報(bào)道稱(chēng)由于染色體重塑異常、癌基因擴(kuò)增等原因可以導(dǎo)致細(xì)胞在分裂間期形成微核。微核作為一種重要的遺傳毒理學(xué)和基因組不穩(wěn)定性的指標(biāo)，可用于指示遺傳物質(zhì)的損傷程度?，F(xiàn)在

2、國(guó)內(nèi)外常通過(guò)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞以及口腔、鼻腔等部位剝落的上皮細(xì)胞的微核發(fā)生頻率來(lái)評(píng)價(jià)各種傷害引起的細(xì)胞遺傳學(xué)損傷程度，由此可見(jiàn)微核分析的普遍性和重要性。但是，作為一種如此重要的基因組不穩(wěn)定性的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，微核的發(fā)生機(jī)制還沒(méi)有完全的定論。
　　 除微核以外，組蛋白H2AX的磷酸化，簡(jiǎn)稱(chēng)γ-H2AX，也是判斷DNA損傷的重要指標(biāo)。一旦DNA發(fā)生雙鏈斷裂損傷，就可以激活A(yù)TM/ATR通路，使DNA雙鏈斷裂部位的組蛋白H2AX在絲氨酸13

3、9位迅速的發(fā)生磷酸化。組蛋白H2AX發(fā)生磷酸化后，大量的DNA修復(fù)因子被招募到損傷位點(diǎn)處，并對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)。使用γ-H2AX的抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)到H2AX的磷酸化，并在熒光顯微鏡下觀察到可見(jiàn)的γ-H2AX染色信號(hào)，這已經(jīng)成為測(cè)定DNA雙鏈斷裂損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。γ-H2AX染色信號(hào)主要以均勻彌散的γ-H2AX染色以及γ-H2AX焦點(diǎn)兩種形式存在。當(dāng)細(xì)胞遭遇DNA復(fù)制壓力、受到高濃度的氯化鈉處理、或者經(jīng)過(guò)乏氧處理后，細(xì)胞核中會(huì)出現(xiàn)均勻

4、彌散的γ-H2AX染色;而細(xì)胞受到電離輻射處理后，細(xì)胞核中會(huì)出現(xiàn)大量分散的γ-H2AX焦點(diǎn)。因此，對(duì)受到損傷因素處理的細(xì)胞而言，通過(guò)觀察其H2AX磷酸化的程度和分布形式，可以幫助我們對(duì)其DNA雙鏈斷裂損傷進(jìn)行定位及定量的研究。
　　 活性氧(ROS)是生物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥自由基、一氧化氮等活性含氧化合物的總稱(chēng)。很多內(nèi)源性因素以及外源性因素都能夠?qū)е翿OS的產(chǎn)生。如果細(xì)胞不能維持內(nèi)環(huán)境中ROS水平的穩(wěn)定，則會(huì)導(dǎo)致

5、一系列嚴(yán)重后果。因此，為了維持正常的生命活動(dòng)，細(xì)胞通過(guò)多種機(jī)制對(duì)ROS水平進(jìn)行調(diào)控，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使細(xì)胞維持正常的生長(zhǎng)和代謝。ROS與DNA損傷之間存在密切關(guān)系。一方面，ROS能夠?qū)е露喾N形式的DNA損傷，如DNA構(gòu)象改變、堿基損傷、單鏈斷裂損傷以及雙鏈斷裂損傷。另一方面，持續(xù)的DNA損傷能夠?qū)е翿OS水平增高。越來(lái)越多的研究表明，DNA修復(fù)的關(guān)鍵蛋白丟失后，能夠造成嚴(yán)重的DNA損傷，從而導(dǎo)致ROS水平的增高。綜上所述，ROS可

6、導(dǎo)致多種形式的DNA損傷，后者也可以反過(guò)來(lái)導(dǎo)致ROS水平的增高，兩者之間存在正反饋?zhàn)饔谩?br>　　 我們?cè)趯?duì)多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行γ-H2AX免疫熒光實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中觀察到某些微核呈現(xiàn)均勻的彌散性的γ-H2AX染色，稱(chēng)之為γ-H2AX陽(yáng)性微核或MN-γ-H2AX(+)。為了進(jìn)一步明確這類(lèi)新型微核的存在及其特征，并深入探討這類(lèi)新型微核的發(fā)生機(jī)制，本課題從以下兩方面進(jìn)行研究:
　　 第一部分：
　　 DNA復(fù)制壓力誘發(fā)含有大

7、量DNA雙鏈斷裂損傷的新型MN-γ-H2AX(+)
　　 為了明確MN-γ-H2AX(+)這類(lèi)新型微核發(fā)生的普遍性，我們對(duì)多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，并選擇了人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7進(jìn)行進(jìn)一步的研究。通過(guò)使用藥物阻止DNA復(fù)制或使用具有DNA復(fù)制遺傳缺陷的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，我們分析了DNA復(fù)制壓力與這類(lèi)新型微核形成的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)對(duì)多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)和微核計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　

8、　 1)微核分為MN-γ-H2AX(+)和MN-γ-H2AX(-)。MN-γ-H2AX(+)的特征為:微核中顯示出均勻彌散的γ-H2AX染色，并且這種彌散性的γ-H2AX染色幾乎占據(jù)了整個(gè)微核。
　　 2)MN-γ-H2AX(+)的存在具有普遍性。不同細(xì)胞中MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率有所不同，大約在0.5％到4％之間，占總微核的比例數(shù)在20％-50％之間。
　　 2.使用藥物處理MCF-7細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)MN-γ-H

9、2AX(+)的發(fā)生頻率，結(jié)果如下:
　　 1)使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示，未經(jīng)藥物處理組的S期細(xì)胞比例數(shù)為30％左右，而羥基脲、胸苷嘧啶、阿非迪霉素處理組的S期細(xì)胞比例數(shù)增至60％左右，說(shuō)明藥物處理使細(xì)胞停滯于S期。
　　 2)使用導(dǎo)致S期停滯的藥物羥基脲、阿非迪霉素、胸苷嘧啶處理MCF-7細(xì)胞，微核計(jì)數(shù)結(jié)果顯示MN-γ-H2AX(+)發(fā)生頻率的增加幅度遠(yuǎn)大于MN-γ-H2AX(-)發(fā)生頻率的增加幅度。

10、
　　 3)紫杉醇通過(guò)抑制微管解聚使細(xì)胞停滯于有絲分裂中期，使用紫杉醇處理MCF-7細(xì)胞，產(chǎn)生的主要是MN-γ-H2AX（-），而MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率并沒(méi)有明顯改變。
　　 3.使用不同藥物（阿非迪霉素、羥基脲、胸苷嘧啶、紫杉醇）處理MCF-7細(xì)胞24h后，更換為新鮮完全培養(yǎng)基釋放不同時(shí)間(0h，6h，24h，48h，72h，96h)，微核計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:
　　 1)藥物處理后未經(jīng)釋放的細(xì)胞中，MN-

11、γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率已有明顯增高;藥物處理后分別進(jìn)行6h、24h、48h、72h釋放的細(xì)胞中，MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率均高于未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組細(xì)胞;藥物處理后進(jìn)行96h釋放的細(xì)胞中，MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率幾乎恢復(fù)到本底水平。
　　 2)根據(jù)藥物處理后，細(xì)胞核中γ-H2AX染色的情況將細(xì)胞分為三類(lèi):對(duì)于整個(gè)細(xì)胞核均呈現(xiàn)出均勻彌散性γ-H2AX染色的細(xì)胞，我們將其定義為一類(lèi)細(xì)胞;對(duì)于細(xì)胞核中存在大量γ

12、-H2AX焦點(diǎn)的細(xì)胞，我們將其定義為二類(lèi)細(xì)胞;對(duì)于細(xì)胞核中幾乎沒(méi)有γ-H2AX信號(hào)的細(xì)胞，我們將其定義為三類(lèi)細(xì)胞。結(jié)合各類(lèi)細(xì)胞占總細(xì)胞的比例以及細(xì)胞周期結(jié)果推測(cè)，藥物處理后所檢測(cè)到的一類(lèi)細(xì)胞與二類(lèi)細(xì)胞很有可能是處于S期且經(jīng)歷DNA復(fù)制壓力的細(xì)胞。藥物處理后對(duì)不同釋放時(shí)間各類(lèi)細(xì)胞產(chǎn)生的微核數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用阻止DNA復(fù)制的藥物處理后，未經(jīng)釋放的情況下，大多數(shù)新產(chǎn)生的MN-γ-H2AX(+)都是由處于S期的一類(lèi)細(xì)胞與二類(lèi)細(xì)胞產(chǎn)生的。

13、由此明確了MN-γ-H2AX(+)是在S期形成的。
　　 4.免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察小鼠皮膚成纖維細(xì)胞(MSF)發(fā)現(xiàn)有γ-H2AX信號(hào)在細(xì)胞核外周聚集成簇并且有向外突出的趨勢(shì)，推測(cè)這樣的細(xì)胞核突出部位很可能是MN-γ-H2AX(+)的前體。
　　 5.使用具有DNA復(fù)制遺傳缺陷的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　 1)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和BrdU摻入實(shí)驗(yàn)證明，在RPA1低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中存在DNA復(fù)制壓力。
　　

14、 2)通過(guò)微核計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照細(xì)胞相比，RPA1低表達(dá)細(xì)胞中MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率有所增高。
　　 綜上所述，MN-γ-H2AX(+)是一種新型微核，它不同于傳統(tǒng)意義上有絲分裂后期形成的微核，主要是在細(xì)胞分裂間期形成的。我們推測(cè)這類(lèi)微核的形成原因是細(xì)胞在S期遭遇DNA復(fù)制壓力，進(jìn)而導(dǎo)致了大量的DNA雙鏈斷裂損傷，這些無(wú)法修復(fù)的損傷部位聚集在一起排出細(xì)胞主核，形成MN-γ-H2AX(+)。研究這類(lèi)新型的MN-γ-H2A

15、X(+)有助于我們認(rèn)識(shí)DNA復(fù)制壓力所引起的基因組不穩(wěn)定性，以及評(píng)估導(dǎo)致DNA復(fù)制壓力的遺傳和環(huán)境因素。
　　 第二部分：
　　 活性氧(ROS)導(dǎo)致MN-γ-H2AX(+)發(fā)生頻率增高
　　 第一部分的研究證明DNA復(fù)制壓力能夠誘發(fā)MN-γ-H2AX(+)，且有多項(xiàng)研究證明ROS能夠?qū)е虏煌问降腄NA損傷，因此我們接下來(lái)研究了ROS水平與MN-γ-H2AX(+)形成之間的關(guān)系。我們使用藥物影響ROS水平以及使

16、用具有抗氧化基因缺陷的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率;同時(shí)使用具有抗氧化作用的藥物對(duì)以上細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合處理，以抑制細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增高，分析ROS與MN-γ-H2AX(+)形成的關(guān)系。
　　 1.使用導(dǎo)致ROS水平增高的藥物過(guò)氧化氫(H2O2)以及具有抗氧化作用的藥物N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理細(xì)胞，結(jié)果如下:
　　 1)使用不同濃度的H2O2(50μM，100μM，150μM)處理U2OS細(xì)胞不

17、同時(shí)間(2h，6h，12h，24h)，隨后更換為新鮮完全培養(yǎng)基釋放48h，檢測(cè)MN-γ-H2AX(+)的形成情況。結(jié)果顯示，H2O2能夠誘發(fā)MN-γ-H2AX(+)，且呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。
　　 2)使用具有抗氧化作用的藥物NAC與H2O2聯(lián)合處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC能夠下調(diào)H2O2所造成的MN-γ-H2AX(+)發(fā)生頻率的增高。從而通過(guò)藥物實(shí)驗(yàn)證明了ROS能夠誘發(fā)MN-γ-H2AX(+)。
　　 2.通過(guò)不同方

18、式使具有抗氧化作用的基因p53功能改變后，檢測(cè)MN-γ-H2AX(+)發(fā)生頻率的變化情況。結(jié)果如下:
　　 1)使用p53激活劑nutlin-3處理U2OS細(xì)胞，MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率有所降低。
　　 2)使用p53抑制劑pifithrin-α處理U2OS細(xì)胞，MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率有明顯增高。
　　 3)使用p53功能缺陷的U2OS細(xì)胞以及p53缺失的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

19、:與對(duì)照細(xì)胞相比，p53功能缺陷的細(xì)胞中，MN-γ-H2AX(+)的發(fā)生頻率有明顯增高。
　　 4)使用具有抗氧化作用的藥物NAC處理p53功能缺陷細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn):NAC能夠下調(diào)由于p53功能缺陷而導(dǎo)致的MN-γ-H2AX(+)發(fā)生頻率的增高。
　　 3.為了了解p53下游基因?qū)N-γ-H2AX(+)形成的影響，我們使用siRNA抑制p53下游具有抗氧化作用的基因SESN1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照細(xì)胞相比，