應(yīng)用彗星實驗和γH2AX焦點方法檢測DNA雙鏈斷裂的比較研究.pdf

1、癌癥是當前除心血管系統(tǒng)疾病外導致死亡的第二大因素，外源環(huán)境致癌物的暴露與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。大多數(shù)致癌物都是遺傳毒素，這些遺傳毒素能夠直接或間接的作用于DNA，最后導致各種形式的DNA損傷，包括DNA單鏈斷裂(DNAsingle-strandedbreaks，SSBs)、雙鏈斷裂(DNAdouble-strandedbreaks，DSBs)、DNA加合物(DNAadducts)形成、鏈內(nèi)/鏈間交聯(lián)(intra-orinter-str

2、andcross-links)和堿基置換等等。其中，DNA鏈的斷裂尤其是DNA雙鏈的斷裂被認為是最嚴重的DNA損傷。因此，檢測遺傳毒素所導致的對DNA的損傷尤其是DSBs將有助于我們對于環(huán)境致癌物的檢測，從而有助于對癌癥的預防和治療。 近幾年來，γH2AX與DNA雙鏈斷裂之間的關(guān)系逐漸引起了人們的注意。γH2AX是組蛋白H2A家族中的一員H2AX的磷酸化形式。當細胞中發(fā)生DNA雙鏈斷裂時，H2AX被迅速磷酸化為γH2AX并且形成

3、可以在熒光顯微鏡下清楚可辨的焦點。隨后，γH2AX在DNA雙鏈斷裂的損傷修復過程中發(fā)揮作用，它可以募集一些損傷修復相關(guān)蛋白，如BRCA1、53BP1、Rad50和NBS1等，對DSBs進行修復。由于研究證明γH2AX所形成的焦點的數(shù)量與IR造成的DNA雙鏈斷裂數(shù)量存在一一對應(yīng)關(guān)系，并且γH2AX焦點的形成與消失這一過程與DSBs的形成與修復有一定的相關(guān)性，因此被認為可以用來作為一種靈敏地檢測DSBs的有效指標。目前已被用來檢測多種化合物

4、、病毒、甚至熱休克誘導的DSBs的形成。 彗星實驗是一種經(jīng)典的在單細胞水平上檢測DNA損傷的方法，被廣泛應(yīng)用于放射生物學、DNA損傷與修復、DNA交聯(lián)、細胞凋亡及遺傳毒理等領(lǐng)域的研究。彗星實驗主要有兩種方法：一種是中性彗星實驗，被廣泛用來檢測DSBs；另外一種是堿性彗星實驗，可以用來檢測DSBs和SSBs，以及堿基修飾等其他類型的DNA損傷。 單功能烷化劑甲基硝基亞硝基胍(N-methyl-N'nitro-N-nitro

5、soguanidine，MNNG)是一種在環(huán)境中廣泛存在的化學誘變劑和致癌劑。它是一種N-亞硝基化合物，屬于可直接與DNA作用的遺傳毒物，通過直接靶定DNA而誘發(fā)細胞產(chǎn)生遺傳毒性應(yīng)激，并導致染色體異常、姐妹染色單體改變、點突變以及細胞死亡，是化學致癌物誘變機理研究中常用的一種模式化合物。此外，研究者們應(yīng)用彗星實驗發(fā)現(xiàn)MNNG能誘導細胞DNA雙鏈斷裂的形成 盡管γH2AX焦點的形成被認為是檢測DNA損傷的一種有效方法，但是，在廣泛

6、應(yīng)用到研究、臨床及其他領(lǐng)域中前，我們?nèi)匀恍枰M一步的驗證確定它的可行性。因此，我們采用MNNG作為模式化合物，分別應(yīng)用γH2AX焦點分析及彗星實驗分析MNNG處理后的DNA損傷情況，并作系統(tǒng)性的比較。 MNNG誘導人FL細胞中γH2AX焦點的形成，并且有明顯的時間、劑量效應(yīng) FL細胞用不同濃度的MNNG以及溶劑對照DMSO處理不同時間段后，應(yīng)用免疫熒光顯微鏡觀察細胞中γH2AX焦點的形成情況。 結(jié)果：MNNG誘導

7、的FL細胞中γH2AX焦點的形成有明顯的時間、劑量效應(yīng)。0.1和1μg/mlMNNG均能誘導FL細胞中γH2AX焦點的顯著增加，但是，在48小時處理階段內(nèi)，0.1μg/mlMNNG所誘導的γH2AX焦點的形成有一個明顯的上升然后再降低的過程，暗示細胞中的DSBs可能被修復；而1μg/mlMNNG所誘導的γH2AX焦點的形成在48小時階段一直維持著上升階段。而對于高濃度10μg/mlMNNG所處理的FL細胞，我們觀察到了一種特殊的全核γH

8、2AX染色方式。 中性彗星實驗揭示MNNG誘導人FL細胞中DNA雙鏈斷裂的發(fā)生FL細胞在經(jīng)過不同濃度的MNNG處理不同時間段后，應(yīng)用中性彗星實驗觀察細胞中DSBs的發(fā)生情況。 結(jié)果：0.1和1μg/mlMNNG均能誘導FL細胞慧尾的顯著增加。0.1μg/mlMNNG處理2小時后，慧尾明顯增加，但是，在24小時時間點，0.1μg/mlMNNG誘導的慧尾相對8小時時間點發(fā)生明顯的降低，并且在48小時時間點，0.1μg/mlM

9、NNG誘導的慧尾與control-和DMSO-處理組細胞的慧尾相類似；而1μg/mlMNNG同樣在處理細胞2小時后慧尾明顯增加，并且這一趨勢一直維持到了48小時。而對于10μg/mlMNNG，在8小時時間段內(nèi)，慧尾相對于control-,DMSO-組都沒有發(fā)生變化，并且在24小時時間點時，沒有細胞產(chǎn)生慧尾，只有在48小時時間點時，慧尾才發(fā)生明顯增加。 堿性彗星實驗揭示全核γH2AX染色方式細胞中有DNA損傷的存在將10μg/ml

10、MNNG處理2小時的FL細胞進一步用堿性彗星實驗來檢測其中的DNA損傷。 結(jié)果：10μg/mlMNNG處理2小時的FL細胞中產(chǎn)生了明顯的慧尾，并且與control-,DMSO-組比有明顯的差異。說明有DNA損傷的存在。 MNNG誘導CHL細胞中γHH2AX焦點的形成，并且有明顯的時間效應(yīng)CHL細胞經(jīng)過1μg/mlMNNG處理不同時間段后，應(yīng)用免疫熒光顯微鏡觀察細胞中γH2AX焦點的形成情況。 結(jié)果：MNNG誘導了

11、CHL細胞中γH2AX焦點的形成，并且有明顯的時間效應(yīng)性。因此，MNNG誘導的γH2AX焦點的形成是沒有細胞系依賴性的。Wortmannin抑制了MNNG誘導的γH2AX焦點的形成 應(yīng)用200μMwortmannin孵育30分鐘后，1μg/mlMNNG處理FL細胞1.5小時，再加入200μMwortmannin，共同孵育30分鐘后，熒光顯微鏡觀察γH2AX焦點的形成情況。 結(jié)果：經(jīng)過wortmannin共孵育后，1μg/

12、mlMNNG誘導的γH2AX焦點的形成相對只經(jīng)過1μg/mlMNNG處理的FL細胞中γH2AX焦點發(fā)生明顯的降低。因此，Wortmannin能抑制MNNG誘導的γH2AX焦點的形成。 結(jié)論：第一，雖然免疫熒光實驗觀測到的γH2AX焦點的形成結(jié)果與中性彗星實驗結(jié)果在具體的數(shù)值上在一定程度上存在著差異，但是整體的趨勢是一致的，說明這兩種方法的結(jié)果有一定的吻合性。因此，γH2AX焦點的形成能夠成為檢測DSBs的一種新的特異性指標，另外