新的可視化定量化DNA雙鏈斷裂修復(fù)檢測(cè)體系的建立及在斑馬魚中應(yīng)用研究.pdf

1、有機(jī)體的正常生長、發(fā)育和繁殖需要正確完整的遺傳信息。然而體內(nèi)（如水解，氧化，烷基化，復(fù)制堿基錯(cuò)配等）和體外（射線輻射，紫外輻射，不同的化學(xué)試劑等）多種不同物理化學(xué)因素的影響經(jīng)常會(huì)造成遺傳信息的攜帶者的DNA損傷。DNA損傷最嚴(yán)重的形式是DNA雙鏈斷裂。如果DNA斷裂不能正確的修復(fù)，這不僅影響有機(jī)體的正常發(fā)育和衰老，而更重要的是基因組的不完整性會(huì)導(dǎo)致我們?nèi)祟惾菀谆忌厦庖呷狈?，神?jīng)系統(tǒng)紊亂和癌癥等疾病。為了減少DNA雙鏈斷裂帶來的傷害，有機(jī)

2、體進(jìn)化出三種DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑，即同源重組修復(fù)途徑(HR)、單鏈退火修復(fù)途徑(SSA)及非同源末端連接途徑(NHEJ)。檢測(cè)不同DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑一般采用綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，通過在報(bào)告基因中引入大范圍核酸酶（如I-SceI）切點(diǎn)，構(gòu)建可檢測(cè)不同修復(fù)途徑載體。到目前為止，絕大部分的研究工作都是在細(xì)胞系中完成的，對(duì)于這三種修復(fù)途徑在有機(jī)體發(fā)育過程中的作用和調(diào)控還鮮有報(bào)道。在此項(xiàng)研究中我們通過新的設(shè)計(jì)，利用斑馬魚模式生物，構(gòu)建了三

3、個(gè)可視化并且可定量化的DNA雙鏈修復(fù)檢測(cè)體系分別檢測(cè)HR，SSA和NHEJ。在新的設(shè)計(jì)中我們采用正反兩個(gè)I-SceI大范圍核酸酶的酶切識(shí)別位點(diǎn)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的一個(gè)酶切位點(diǎn)來創(chuàng)造DNA雙鏈斷裂，此種設(shè)計(jì)可將單酶切產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂的粘性末端變?yōu)榉钦承阅┒?，從而大大降低粘性末端帶來的末端直接連接修復(fù)。結(jié)果顯示采用新的設(shè)計(jì)我們不但可以在斑馬魚胚胎中通過綠色熒光的表達(dá)清楚觀察到NHEJ、SSA和HR修復(fù)，而且各種修復(fù)的頻率可通過我們?nèi)略O(shè)計(jì)的引物采

4、用定量PCR(qPCR)的方法定量檢測(cè)。DNA斷裂處修復(fù)后DNA序列分析結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)HR、SSA修復(fù)的發(fā)生，并且顯示在胚胎發(fā)育過程中NHEJ在此三種DNA雙聯(lián)修復(fù)途徑中占主導(dǎo)地位。
　　 為了測(cè)試這三個(gè)報(bào)告體系是否可以用于DNA雙鏈修復(fù)中基因功能分析，我們通過反義嗎啉代寡核苷酸分別敲低rad51(HR修復(fù)中的重組酶)，rad52(SSA修復(fù)中的單鏈DNA結(jié)合蛋白)和ligase4(NHEJ修復(fù)中的連接酶)，結(jié)果顯示敲低這些