直觀檢測(cè)環(huán)境雌激素的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的建立及其應(yīng)用研究.pdf

1、環(huán)境雌激素(EEs)是指能夠模擬體內(nèi)天然雌激素功能的人工合成或植物提取的化合物。這些物質(zhì)已被證明能夠?qū)е聞?dòng)物和人類的性別混淆和生殖功能受損。此外，它們還能誘導(dǎo)雄性和幼年魚類表達(dá)雌性特異性蛋白，如卵黃蛋白原(VTG)。
　　 為了能快速、直觀、活體檢測(cè)環(huán)境雌激素，我們建立了轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。首先，我們用RT-PCR和整體原位雜交的方法顯示了雌激素類化合物17α-炔雌醇(EE2)誘導(dǎo)斑馬魚卵黃蛋白原1(zvtg1)基因在胚胎和幼魚體內(nèi)

2、的表達(dá)模式。第二，我們克隆了zvtg1基因上游兩段調(diào)控序列，并使其在MCF-7細(xì)胞株中誘導(dǎo)表達(dá)下游綠色熒光蛋白基因(gpf)，由此體外驗(yàn)證1720bp DNA片段具有啟動(dòng)子活性。第三，融合基因zvtg1：gfp1顯微注射1-2細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中，經(jīng)EE2處理后幼魚肝臟出現(xiàn)綠色熒光。由此從活體驗(yàn)證1720bp DNA片段的啟動(dòng)子活性。第四，為了增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因斑馬魚綠色熒光蛋白的表達(dá)，我們合成了一段來(lái)源于爪蟾卵黃蛋白原A2基因的39bp的DN

3、A片段，該片段含有雌激素反應(yīng)元件(ere)的序列。這段DNA插入zvtg1啟動(dòng)子的上游，得到融合基因ere-zvtg1：gfp，并顯微注射斑馬魚胚胎。然后用10ng/L的EE2處理6天，用熒光顯微鏡觀察肝臟熒光，進(jìn)行篩選。出現(xiàn)熒光的幼魚繼續(xù)飼養(yǎng)至性成熟，與野生型斑馬魚雜交，其后代也用10ng/L的EE2處理6天，觀察熒光進(jìn)行篩選。在119條F0代斑馬魚中，發(fā)現(xiàn)一條能將熒光傳遞到F1代。最后只有兩條F1代雄魚存活下來(lái)，并和野生型雌魚雜交得

4、到F2代。F2代的雌魚和雄魚互相交配，得到F3代。F3再和野生型雜交，用EE2篩選出現(xiàn)熒光的F4代。最后，能將熒光100％傳遞到F4代的F3代被確定為純合子，從而建立ere-zvtg1：gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。
　　 在這種轉(zhuǎn)基因斑馬魚系中，綠色熒光蛋白(GFP)特異性地在成熟雌魚肝臟表達(dá)。雄性和幼年轉(zhuǎn)基因斑馬魚不表達(dá)GFP，但是在EE2誘導(dǎo)后其肝臟也能出現(xiàn)熒光。胚胎和幼魚中zvtg1 mRNA和綠色熒光出現(xiàn)的時(shí)空一致，說(shuō)明gfp

5、基因是在zvtg1啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)。
　　 1-2細(xì)胞期的轉(zhuǎn)基因斑馬魚分別用100，10，1，0.1 ng/L的EE2處理，最早觀察到熒光的時(shí)間分別為53，74，100和131小時(shí)。成年雄性轉(zhuǎn)基因斑馬魚分別用100，10，1，0.1 ng/L的EE2處理，最早觀察到熒光的時(shí)間分別為2，3，4，和7天。成熟雌性轉(zhuǎn)基因斑馬魚雖然肝臟已經(jīng)有熒光，但是相對(duì)較高濃度(10和100ng/L)的EE2仍然能夠誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)

6、，肝臟的綠色熒光有增強(qiáng)趨勢(shì)，而撤去EE2后一段時(shí)間熒光逐漸消失。分別用具有雌激素活性的化合物和沒(méi)有雌激素活性的甾體類激素測(cè)試ere-zvtg1：gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚發(fā)射熒光的反應(yīng)，結(jié)果雌激素類物質(zhì)處理幼魚13天后，誘導(dǎo)熒光所需的濃度分別為：己烯雌酚50 ng/L，雌二醇0.1μg/L，雌三醇1μg/L，氯化鎘10μg/L，玉米赤霉烯酮50μg/L，雙酚A1mg/L。弱雌激素壬基酚濃度達(dá)到10mg/L時(shí)仍未能誘導(dǎo)綠色熒光出現(xiàn)。其它甾體類激素

7、如孕激素和17-羥固醇即使?jié)舛冗_(dá)到100mg/L和50mg/L，仍不能誘導(dǎo)熒光出現(xiàn)。這種轉(zhuǎn)基因斑馬魚能檢測(cè)濃度很低的環(huán)境雌激素，而且所需的暴露時(shí)間很短，因此有望應(yīng)用于直觀，快速，簡(jiǎn)便地監(jiān)測(cè)環(huán)境雌激素。
　　 利用這種轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，研究EE2誘導(dǎo)zvtg1表達(dá)的分子機(jī)制，結(jié)果提示雌激素受體β是EE2誘導(dǎo)zvtg1表達(dá)所必須的；環(huán)境雌激素EE2濃度達(dá)500ng/L時(shí)斑馬魚胚胎原始生殖細(xì)胞(PGCs)遷移異常，這種效應(yīng)與雌激素受體無(wú)