五種IGF信號通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的構(gòu)建.pdf

1、類胰島素生長因子(IGF，insulin-like growth factor)信號系統(tǒng)是一個(gè)進(jìn)化上相對保守的信號途徑，該信號系統(tǒng)主要由2種配體(IGF-Ⅰ，IGF-Ⅱ)、2種受體(IGF-ⅠR，IGF-ⅡR)和6種IGF結(jié)合蛋白(IGFBP)組成，研究表明IGF信號系統(tǒng)在調(diào)節(jié)胚胎生長和分化、維持成體生理功能和調(diào)控生物體衰老方面具有重要作用。近年來，雖然人們對硬骨魚類IGF信號系統(tǒng)展開了較為深入的研究，但還存在著尚未解決的問題。

2、　　越來越多的證據(jù)表明，無論是在體內(nèi)還是體外，IGFBP-4都能夠抑制IGFs誘導(dǎo)的細(xì)胞生長。同時(shí)，IGFBP-4也具有不依賴于IGFs的功能。在許多組織中，IGFBP-4的表達(dá)水平受IGFBP-4蛋白水解酶、營養(yǎng)、部分生長因子和激素的影響。幾種測序的硬骨魚中均含有9～11個(gè)igfbp基因（有倍增基因），只有igfbp-4僅有1個(gè)拷貝（沒有倍增基因），且在斑馬魚中沒有找到igfbp-4基因，目前認(rèn)為斑馬魚igfbp-4基因是在進(jìn)化過程中

3、丟失了。這是否意味著IGFBP-4在生命活動(dòng)中并不重要呢？
　　IGF2BP2屬于mRNA結(jié)合蛋白(IMP)，參與mRNA的定位、穩(wěn)定及運(yùn)輸。IMPs主要在個(gè)體發(fā)育過程中表達(dá)，對于胚胎的生長發(fā)育具有重要的作用。斑馬魚的Igf2bp2a有四種常見的剪切體(Igf2bp2a-a、Igf2bp2a-b、 Igf2bp2a-c、 Igf2bp2a-d)，其中Igf2bp2a-a的結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物Igf2bp2a一致，Igf2bp2a-b、

4、Igf2bp2a-c、Igf2bp2a-d分別較Igf2bp2a-a缺失了部分結(jié)構(gòu)域。
　　IGFBP-1是IGFBP家族中最早被鑒定出的蛋白。IGFBP-1屬于壓力應(yīng)激蛋白，在食物匱乏、缺氧、損傷等條件下，表達(dá)量顯著提高。最近的研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-1是IGF信號通路的分子開關(guān)，在脅迫條件下，IGFBP-1可以將細(xì)胞的代謝水平從生長發(fā)育的狀態(tài)調(diào)整到維持生存的最低水平。
　　本研究使用Tol2-gateway技術(shù)構(gòu)建了5種轉(zhuǎn)

5、基因斑馬魚，分別為:tg(βactin2: IGFBP4)、tg(ziwi:IGF2BP2a-b)、tg(ziwi:IGF2BP2a-c)、tg(ziwi:IGF2BP2a-d)、tg(igfbp-1b:eGFP)，為后續(xù)對于上述幾種基因功能的研究提供了優(yōu)良的模型。
　　為了研究IGFBP-4的功能，本研究使用了紅鰭東方鲀的igfbp-4 ORF序列，并將其連接在持家基因β-ac tin2的啟動(dòng)子下游，使用Tol2-gateway

6、系統(tǒng)將這一段重組序列導(dǎo)入斑馬魚體內(nèi)，從而獲得了可組成型表達(dá)紅鰭東方鲀fbp-4的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系:tg(βactin2: IGFBP4)。
　　為了研究斑馬魚igf2bp2a的功能，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了tg(ziwi:IGF2BP2a-b)、tg(ziwi:IGF2BP2a-c)、tg(ziwi:IGF2BP2a-d)三種轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系。
　　為了研究斑馬魚igfbp-1b啟動(dòng)子的特性，本實(shí)驗(yàn)克隆了潛在的igfbp-1b啟動(dòng)子序列（即