斑馬魚中LMNA基因的克隆.pdf

1、目的：LMNA基因及其編碼蛋白lamin A/C異常能引起一組人類遺傳病,稱為核纖層蛋白病,哺乳動物中 LMNA基因有4個轉(zhuǎn)錄本,分別是 laminA、laminC、laminA10,laminC2,其中 laminA、laminC是主要的亞型,目前已證明脊椎動物中該基因與哺乳動物同源性較高,而在斑馬魚已成功克隆出laminA基因,laminC基因尚未克隆出,本實驗利用3’RACE技術(shù)克隆斑馬魚laminC基因，以確定斑馬魚中LMNA基

2、因不同的轉(zhuǎn)錄本，為進(jìn)一步研究LMNA基因轉(zhuǎn)錄本的功能，奠定重要的基礎(chǔ)。
　　方法:通過收集斑馬魚全時相的胚胎,利用trizol方法提取RNA,后根據(jù)3’race試劑盒所帶的逆轉(zhuǎn)錄體系將所提取的total RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。然后再使用TaKaRa LA Taq以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)，套式PCR（巢式PCR）通過兩輪PCR反應(yīng),使用兩套引物擴增特異性的DNA片段,第二套引物功能特異性擴增位于首輪PCR產(chǎn)物

3、的一段DNA片段,從而提高反應(yīng)的特異性。最后將PCR產(chǎn)物直接送測序。
　　結(jié)果：成功運用巢式PCR方法克隆基因，得到了581bp的片段,并進(jìn)行了測序,測序結(jié)果與laminA基因相似度達(dá)98％,未克隆到laminC基因。
　　結(jié)論：通過新實驗技術(shù)驗證了斑馬魚中可能只存在laminA基因,無laminC基因,但因目前l(fā)aminA/C的剪接位點是針對哺乳動物的，斑馬魚是一種較低等的脊椎動物，所以可能斑馬魚中l(wèi)aminC的可變剪接位