斑馬魚Jak2a基因的克隆、表達及其對造血功能影響的初步研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 斑馬魚疾病模型及基本實驗技術(shù)
　　斑馬魚運用在造血研究領(lǐng)域已有50余載,對斑馬魚胚胎的研究最早要追溯至19世紀(jì)30年代,前期關(guān)于斑馬魚的研究多限于動物實驗學(xué)及藥物毒理學(xué)方面。1970年首次對斑馬魚的血細胞形態(tài)進行了詳細的闡述。由于近代遺傳學(xué)實驗方法的運用,斑馬魚造血系統(tǒng)的研究進入了“近現(xiàn)代”階段,近十年來主要針對斑馬魚造血系統(tǒng)缺陷突變體的研究,特別是對斑馬魚貧血疾病的認識。

2、r>　　造血系統(tǒng)遺傳學(xué)實驗學(xué)方法的應(yīng)用最先起源于小鼠。起初,實驗研究模型主要來源于自發(fā)突變體的小鼠。而對于特定基因的功能學(xué)研究,仍需依靠體內(nèi)轉(zhuǎn)基因和基因打靶技術(shù),近25年，這些方法占據(jù)了小鼠實驗的主導(dǎo)地位。然而，反向遺傳學(xué)功能性分析研究的基因具有定向性偏倚,并且反向遺傳學(xué)的基因-基因研究方法并不能闡述所有的造血系功能基因。因此,傳統(tǒng)的人類血液學(xué)疾病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)仍不明確。
　　果蠅的造血系統(tǒng)與脊椎動物如哺乳動物是不同的。在基因水平,

3、果蠅造血系轉(zhuǎn)錄因子家族和信號通路是具有代表性的,然而在細胞水平,相對哺乳動物,果蠅的造血系發(fā)育較原始,且固有免疫缺失。
　　運用正向遺傳學(xué)篩選法尋找造血系突變體已有報道,包括預(yù)期的(Ikaros13,c-Myb14,Gata-115)突變和預(yù)期外的突變(C1galt116,Bcl-x(L)17)。大量研究證實小鼠遺傳學(xué)篩選法具備可行性,然而其高成本以及對設(shè)備的高要求性,限制了其運用的廣泛性，常用于少數(shù)大規(guī)模性研究。因此，理論上，遺

4、傳學(xué)篩查法的應(yīng)用十分困難。而斑馬魚作為廉價，易飼養(yǎng)的脊椎動物模型,特別適用于研究胚胎早期發(fā)育(如體外發(fā)育快,繁殖力強,視覺透明性)。反向遺傳學(xué)技術(shù)多運用于斑馬魚目標(biāo)基因的功能性研究，包括基因暫時性過表達和基因敲除,穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因系可通過TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)或者從插入突變編目目錄中恢復(fù)穩(wěn)定的突變等位基因獲得。正向遺傳學(xué)篩選法獲得的斑馬魚突變體為造血系疾病研究提供

5、了良好的動物模型。最新的正向遺傳學(xué)篩選法已經(jīng)大規(guī)模展開,包括獲得造血系突變體在內(nèi)的研究正在進行,已報道的8個實驗組正在篩選斑馬魚造血系突變體,提示正向遺傳學(xué)篩選方案具有很強的可實施性。
　　1.斑馬魚的正常造血
　　1.1胚胎造血研究
　　與哺乳動物卵黃囊造血類似，斑馬魚原始造血/胚胎造血位于解剖位置相互獨立的兩個中胚層。紅系發(fā)生細胞最早起源于原腸腔前期胚胎的腹側(cè)位;分裂的開始即注定要形成后側(cè)中胚層(LPM,然后發(fā)生系

6、列特異性分化基因的表達。經(jīng)過遺傳形態(tài)學(xué)演變,LPM形成一個縱向的造血區(qū)－中間細胞團ICM區(qū)，其不僅表達gata1,且形成了具有紅細胞循環(huán)的循環(huán)系統(tǒng)。
　　另一獨立造血區(qū)位于胚胎囊胚泡背側(cè)面，位于心臟起源細胞前面。它們形成了LPM的前部，伴隨第一批原始髓系細胞的遷出，它們表達spil(pu.1)而不表達gata1。進入循環(huán)系統(tǒng)的活性吞噬細胞及胚胎巨噬細胞分布在卵黃囊且貫穿于整個胚胎期,推測具備特定表型的定居巨噬細胞,在48hpf時可

7、能演變成為原始的中性粒細胞。
　　決定性造血始于48hpf的胚胎,這些細胞團位于背主動脈腹壁的Notch-和Hedgehog-信號區(qū),呈runx-1依賴性。此階段的造血類似于哺乳動物背面腸系膜(AGM)造血期。在主動脈造血祖細胞的發(fā)育過程中Runx1的作用是必須的。腎臟是幼蟲發(fā)育至成魚階段最主要的造血器官。
　　1.2血細胞的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)
　　斑馬魚體形較小，因此不像正常大型成年魚類造血指標(biāo)的簡單直觀?？偨Y(jié)了通過標(biāo)志

8、基因的檢測,細胞化學(xué)染色法,免疫組化或者熒光轉(zhuǎn)基因魚的熒光細胞法特異性識別血細胞類型。特殊細胞通過流式細胞學(xué)對腎髓細胞懸液進行物理特性的檢測或者通過轉(zhuǎn)基因魚系的特殊系別熒光來進行鑒別,細胞懸液須取材于完整的胚胎。
　　斑馬魚造血細胞的鑒定方法(來自Duncan Carradice的zebrafish in hematology:sushi or science?)
　　1.3紅細胞及紅系造血
　　類似于鳥類和爬行類動物

9、,斑馬魚紅細胞呈橢圓形態(tài)(7*10μm)且為有核細胞。哺乳動物紅細胞成熟表現(xiàn)為細胞質(zhì)形態(tài)，染色，胞核大小及染色質(zhì)密度的改變。成年斑馬魚紅系造血發(fā)生于前后腎小隙。轉(zhuǎn)錄因子家族成員，如tal1(scl)和GATA-家族轉(zhuǎn)錄因子,對胚胎紅系造血進行了一系列的轉(zhuǎn)錄性調(diào)節(jié),紅細胞生成素與其受體的結(jié)合，JAK激酶和STAT信號分子同樣具備調(diào)節(jié)作用。斑馬魚球蛋白基因座結(jié)構(gòu)復(fù)雜,同時編碼α-和β-鏈,形成血紅蛋白轉(zhuǎn)換域。組織學(xué)分析表明脾臟不僅是斑馬魚的

10、淋巴器官,同時具有紅細胞的儲備及衰老壞死細胞收納的功能。類似哺乳動物,斑馬魚的紅細胞同樣是攜帶氧分子的載體，同時具備調(diào)節(jié)代謝及血流學(xué)動力的作用。作為有核紅細胞,其在酶，代謝及細胞骨架蛋白方面的缺陷使得斑馬魚模型復(fù)制了人類紅細胞疾病表型,形成具有類似缺陷的異常紅細胞。
　　1.4髓細胞及髓系造血
　　成年魚的粒細胞核呈2－3個核分葉，大量表達髓過氧化物酶(mpx),在高分辨率電子顯微鏡下可見胞漿內(nèi)呈片分布的顆粒。隨著胞漿顆粒的

11、累積及核質(zhì)的凝結(jié)聚集，髓系前體細胞在腎小隙內(nèi)完成分葉成熟粒細胞的分化過程。在2dpf時，即可檢測粒細胞髓過氧化物酶的表達。在2-4dpf時，表達髓過氧化物酶的粒細胞數(shù)平均為60-164。在早期胚胎,中性粒細胞已經(jīng)可以參與急性無菌性炎癥反應(yīng)。成年斑馬魚中性粒細胞吞噬能力強弱仍然未知;而胚胎期吞噬活性一般。
　　成魚體內(nèi)亦發(fā)現(xiàn)攜帶無定形態(tài)較大顆粒的噬酸性粒細胞。然而其功能目前尚不明確,尚無可識別性分子標(biāo)記,發(fā)生發(fā)展?fàn)顩r亦不明確。最近，

12、又報道發(fā)現(xiàn)表達羧肽酶的第三類粒細胞,對于其推測性的嗜堿性粒/肥大細胞性粒細胞的描述仍然較少。
　　具備吞噬活性的巨噬細胞是胚胎期首批白細胞,表達drl,spil(pu.1)和lcp1(l-plastin)分子。雖然對個體化細胞共表達標(biāo)記基因進行了檢測,但特殊類型白細胞的獨特標(biāo)志基因仍然不明確。
　　幼魚淋巴系發(fā)生起源于胸腺,發(fā)育的第4天。淋巴細胞特異的核酸探針已用于實驗研究(T淋巴細胞-胸腺rag1和ikaros,B淋巴細胞

13、-免疫球蛋白基因)。雖然文獻已經(jīng)出現(xiàn)針對斑馬魚特異的單克隆抗體及多克隆抗體,然而實際研究中仍然十分缺乏針對斑馬魚白細胞表面分子特異性的多克隆抗體,限制了斑馬魚淋巴細胞亞型和白細胞生物性的研究，且阻礙了適應(yīng)性免疫反應(yīng)的細胞生物學(xué)分析。
　　1.5血小板,血小板生成及凝血
　　斑馬魚有核血小板分布于外周循環(huán)，通過核染色質(zhì)致密性,胞質(zhì)折射性和血小板聚集性,很容易的將其鑒別區(qū)分。血小板的電子顯微鏡下觀,觀察到類似于人類血小板的微管結(jié)

14、構(gòu)及突出的偽足。CD41首先是在發(fā)育2天的幼魚CHT中發(fā)現(xiàn),發(fā)育至3pdf時,血小板的分布除了腎臟的聚集,逐漸進入循環(huán)系統(tǒng)。
　　血小板的功能與哺乳動物類似,同樣具備粘附,分泌及聚集的功能。斑馬魚具備所有主要的凝血蛋白,包括維生素K依賴的促凝因子,抗凝因子和溶解纖維蛋白原系統(tǒng)。斑馬魚凝血系統(tǒng)功能的分析評價主要是通過對相關(guān)凝血指標(biāo)的檢測,包括: APTT,PT,DRVVT。
　　2.斑馬魚的造血調(diào)控
　　2.1造血系統(tǒng)的

15、轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　已有大量文獻報道斑了斑馬魚造血系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。總體來說,基因本身及其功能區(qū)序列的高度保守性導(dǎo)致編碼的功能結(jié)構(gòu)域高度保守性。而在DNA結(jié)合域周圍區(qū)域序列具備多態(tài)性,一些基因家族具有基因的同源類似物或者斑馬魚特異性成員。
　　在哺乳動物中,具備基礎(chǔ)性螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子tal1(scl)和lmo2在造血系統(tǒng)和內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)生發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。Gata1和spi1(pu.1)分別發(fā)揮著維持紅系及髓系造血的系別特異性

16、功能。而runx1和cmyb則具備維持決定性造血的作用。造血轉(zhuǎn)錄因子的交錯暫時性表達提示斑馬魚造血是一個相對保守的程序化過程。研究斑馬魚造血的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控對學(xué)習(xí)哺乳動物的造血調(diào)控有著良好的指導(dǎo)作用,斑馬魚已被證實為較好的異源性模型,主要用于研究人類轉(zhuǎn)錄因子突變及融合蛋白相關(guān)性的疾病。目前,已有實例闡述了斑馬魚轉(zhuǎn)錄因子的遺傳方式,正是這些方式參與構(gòu)成了斑馬魚造血調(diào)控的機制。
　　2.2造血的體液調(diào)節(jié)和細胞因子
　　與斑馬魚造血

17、轉(zhuǎn)錄調(diào)控相對應(yīng)的,還存在其它的調(diào)控機制如造血因子的調(diào)控。
　　對斑馬魚Ⅲ型酪氨酸激酶受體csf1r和kitα的檢測,提示斑馬魚CSF和SCF配體的存在,但是它們在魚體內(nèi)的具體作用仍尚未明確。Panther和sparse突變體(分別是csf1r和kita基因相關(guān)的)均為穩(wěn)定的成魚系,類似于小鼠源性突變體,它們均為顯著的色素沉著表型,但在小鼠體內(nèi)均無具體的造血缺陷表現(xiàn)。
　　KIT同系物情況較復(fù)雜,硬骨魚和四足動物經(jīng)射線輻照后,

18、全套染色體成倍復(fù)制。kita和kitb旁系同源物包括成對的亞功能基因?qū)?除在原始生殖細胞表達外,亦在哺乳動物KIT結(jié)構(gòu)域表達。kita在造血系有表達,但是sparse(kita突變體)卻沒有出現(xiàn)成年斑馬魚的造血缺陷。
　　非酪氨酸激酶造血因子受體在哺乳動物和魚類既有相似之處,又存在差異性。如最廣為人知的EPO信號通路,斑馬魚EPO及其受體與哺乳動物相比,氨基酸同源性低,且重組的人EPO在斑馬魚體內(nèi)無活性,然而對紅系發(fā)育的調(diào)控過程中

19、卻表現(xiàn)功能殘基的生理學(xué)保守性。
　　對促血小生成素(TPO)也有所認識,但僅能從受體mpll及mpll斑馬魚morpholino體和c-Mpl敲除小鼠相似性中推斷其在血小板生成中的作用,它在血小板細胞呈特異性表達。
　　與斑馬魚配體及受體保守性相比,細胞內(nèi)信號通路則更為保守。包括斑馬魚直系同源物基因JAK激酶(jak1,jak2a和jak2b,jak3),STAT分子(stat1和stat3,stat4,stat5.1和st

20、at5.2),以及SOCS負性調(diào)節(jié)因子(socs1,socs3,及ZFIN的16個SOCS基因家族成員)。功能性數(shù)據(jù)顯示,這些分子的確參與了細胞因子和生長因子信號通路作用,且通過保守的生物學(xué)反應(yīng)介導(dǎo)其功能。
　　3.與斑馬魚相關(guān)的血液疾病模型
　　斑馬魚作為良好的疾病模型,對其疾病模型構(gòu)建方法學(xué)及應(yīng)用已有詳細報道。在此,重點介紹血液病學(xué)方面的斑馬魚疾病模型。
　　3.1斑馬魚先天性造血缺陷模型
　　隨機突變ENU

21、突變形成提供了各種斑馬魚造血突變模型。已知某些人類致病基因突變體導(dǎo)致對應(yīng)疾病特點的出現(xiàn),證實斑馬魚突變體可運用于遺傳性造血系統(tǒng)疾病的模型構(gòu)建。相似基因新型突變等位基因的出現(xiàn)為研究基因的新功能及疾病發(fā)病機制提供了更好的依據(jù)。新型基因突變體提示可能的人類疾病基因位點和信號通路的存在。先天性斑馬魚貧血突變體的產(chǎn)生可能是鐵代謝蛋白結(jié)構(gòu)及代謝缺陷所致,從而出現(xiàn)相應(yīng)的貧血性表現(xiàn)。
　　riesling(sptb,β-spectrin)和mer

22、lot/chablis(epb41,band4.1)突變體為典型的紅細胞異常性疾病,且分別模擬了人類遺傳性球形紅細胞增多癥和橢圓性紅細胞性增多癥的臨床表現(xiàn)。與小鼠β-spectrin突變體jaundiced不同,斑馬魚riesling是純合子,因此在模擬人類疾病模型時的表現(xiàn)更加穩(wěn)定。retsina(slc4a1,紅細胞膜帶3蛋白)突變體為異常雙核紅細胞性疾病,模擬了人類先天性紅細胞生成異常性貧血Ⅱ的表現(xiàn)。雖然在人類先天性紅細胞生成異常性

23、貧血Ⅱ尚未發(fā)現(xiàn)SCL4A1突變,但是斑馬魚retsina突變體的發(fā)現(xiàn)為今后研究該疾病病理機制信號通路奠定了基礎(chǔ)。
　　斑馬魚亞鐵血紅素生物合成突變體yquem和dracula模擬了人類血卟啉癥疾病模型,且斑馬魚sauternes(alas2突變體)是最早發(fā)現(xiàn)的先天性鐵粒幼紅細胞性貧血動物模型。位于3號染色體球蛋白基因座的zinfandel,其2個球蛋白基因座結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,且具有6個胚胎性和4個成年斑馬魚球蛋白基因,推測其作為地中海性

24、貧血的斑馬魚模型,主要是由cis活化球蛋白突變導(dǎo)致。
　　大規(guī)模廣泛性的遺傳篩選已為人們篩選到影響髓系發(fā)育的斑馬魚突變體,部分已經(jīng)被報道:ENU篩選的突變體cohesin修飾runx1基因表達;通過增強子捕獲技術(shù)插入到MYC基因家族新成員mych基因而獲得的表達YFP的粒細胞,并沒有因此而對此基因的功能產(chǎn)生影響。
　　3.2惡性血液系統(tǒng)疾病的斑馬魚模型
　　惡性血液系統(tǒng)疾病,包括急性白血病,骨髓增生異常綜合征和骨髓增殖

25、性疾病,都存在類似的斑馬魚病理模型,且模型均具有與人類疾病類似的病理生理特點。
　　通過早期啟動子的運用,建立了淋巴系斑馬魚白血病模型,且提供了在淋巴細胞癌基因表達的時空選擇性調(diào)控機制(比如:rag2啟動子)。疾病的早期致命性牽涉到復(fù)雜轉(zhuǎn)基因系的播散,如rag2:EGFP-Myc引發(fā)的急性淋巴系白血病,且引起對轉(zhuǎn)基因表達方法學(xué)的廣泛關(guān)注。由于是大部分癌基因發(fā)揮主要作用,癌基因的轉(zhuǎn)基因熒光標(biāo)記法在疾病的表型分析方面已得到廣泛運用。今

26、后無論是疾病病理機制推斷或者為建立更加復(fù)雜的疾病模型,白血病發(fā)病機制的信號通路研究都可在斑馬魚體內(nèi)進行模擬。比如,rag2:EGFP-Myc轉(zhuǎn)基因斑馬魚系最終發(fā)展成白血病模型,而rag2:EGFP-bcl2轉(zhuǎn)基因斑馬魚系發(fā)展成為淋巴系統(tǒng)相關(guān)性疾病且不發(fā)生白血病或者淋巴瘤轉(zhuǎn)化。在Bcl2和Myc聯(lián)合性過表達的斑馬魚系,表現(xiàn)為對γ射線呈凋亡抵抗的白血病模型。
　　由于難以找到合適的限制性髓系啟動子,斑馬魚髓系白血病模型出現(xiàn)在淋巴系白血

27、病模型之后。最近報道m(xù)px啟動子成功的運用到轉(zhuǎn)基因斑馬魚系,建立了相應(yīng)的斑馬魚疾病模型。在小鼠髓系白血病模型構(gòu)建過程中發(fā)現(xiàn),必須在適當(dāng)細胞的合適時間產(chǎn)生的癌基因突變才能導(dǎo)致腫瘤。斑馬魚髓系白血病的幾種癌基因的體內(nèi)表達僅為暫時性（比如Tel-jak2a基因）。雖然造血系統(tǒng)的紊亂提示信號通路的生物性活動過程,但其與人類疾病表型的關(guān)系尚不明確。
　　3.3斑馬魚藥物篩選模型
　　對于任何的癌性通路,前期的遺傳學(xué)基礎(chǔ)都可以用來發(fā)現(xiàn)新

28、的通路調(diào)控者;反向遺傳學(xué)方法可用來評估通路的協(xié)同效應(yīng)。同時,這些遺傳學(xué)方法為今后治療方向奠定了基礎(chǔ)。斑馬魚的疾病模型為化學(xué)庫篩選提供了一個直接的工具,尋找需要的分子靶點,并選擇適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)藥理性活性藥物。比如,對于影響細胞增殖的突變體遺傳學(xué)篩選,就是在不斷增多的組蛋白H3免疫染色的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)的separase和bmyb突變體。這些突變體的雜合子可能會增強腫瘤的易感性,提示細胞周期即使發(fā)生微小的波動也會影響魚體內(nèi)的穩(wěn)態(tài),并且細胞周期的調(diào)控異

29、常也會在腫瘤的發(fā)生中產(chǎn)生重要影響。Crash和burn(crb)為化學(xué)遺傳性篩選奠定了基礎(chǔ),為了尋找特征性表型,整個斑馬魚胚胎被暴露在小分子化學(xué)復(fù)合物中,在該過程中,過多的組蛋白H3免疫染色則被抑制。通過該方法廣泛運用,認識了一種新的化合物-persynthamide,crb表型的修飾物。這種篩選的方法能夠成功的對任何細胞周期及腫瘤信號通路進行探索。運用完整的胚胎在細胞系中篩選藥物的的優(yōu)點在于,它不僅效率高,而且對于生物活性及毒性也可以

30、進行篩選。因此,在測試新的化療藥物時可采用此方法。
　　最新報道的另一種斑馬魚的化學(xué)篩選方法,目的在于發(fā)現(xiàn)新的HSC調(diào)控子,并且對前列腺素的信號通路在HSC決定性造血時背主動脈的形成方面有了新的認識。前列腺素E2(PGE2)的減少降低了HSC的數(shù)量,相反,PGE2進行補救性治療則使HSC數(shù)量增加。用PGE2處理輻射后斑馬魚的骨髓,無論是對整體的魚還是體內(nèi)骨髓的治療(小鼠模型),均可以使骨髓造血得以恢復(fù)?；诖?可能為白血病的發(fā)生提

31、供了新的研究方向,并且提示前列腺素作為可能的治療方法,可用于獲得性骨髓造血衰竭和移植后HSC恢復(fù)的治療。
　　總體來說,斑馬魚不僅可以用來構(gòu)建惡性造血系統(tǒng)疾病模型,同時可用來篩選化學(xué)藥物或者是惡性疾病的遺傳性增強子和抑制子,通過篩選可以研發(fā)新的藥物或者是可能的藥物作用靶點。
　　3.4炎癥和感染的斑馬魚模型
　　炎癥和感染的研究使得斑馬魚體內(nèi)造血干細胞功能的研究逐漸被熟知。通過直接的形態(tài)學(xué)觀察,對白細胞的行為,比如遷移

32、和內(nèi)皮移動等有了更加直觀的認識,但這必須借助對斑馬魚體內(nèi)熒光標(biāo)記白細胞的觀察。目前已知大約9個帶熒光標(biāo)記白細胞的斑馬魚系。
　　即使是處于胚胎期的斑馬魚白細胞，亦是作為宿主免疫發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。在機體遭受損傷及細菌污染時，原始中性粒細胞快速遷移到損傷及感染部位，發(fā)揮炎癥吞噬作用，但其吞噬功能比巨噬細胞稍弱，原始巨噬細胞快速吞噬顆粒及細菌。斑馬魚感染模型是通過細菌和病毒病原體感染來構(gòu)建的。對Mycobacterium marium和巨噬

33、細胞間相互作用的詳細闡述，使得轉(zhuǎn)基因感染魚系模型得以構(gòu)建，且運用了帶有熒光標(biāo)記的病原。
　　在此，對斑馬魚造血過程進行了較為深入的討論，證實了其在造血研究和造血系疾病模型構(gòu)建方面的可行性。這篇研究的意義在于討論了斑馬魚在造血研究過程的可行性，且提供了與時俱進的新發(fā)現(xiàn)，為今后的研究作出了一定貢獻。
　　4斑馬魚研究技術(shù)
　　斑馬魚體外受精和胚胎的可觀察性為研究斑馬魚的造血提供了便利。形態(tài)學(xué)突變體即血細胞突變體，胚胎期循環(huán)

34、系統(tǒng)血細胞的可觀察性均已得到廣泛運用。循環(huán)水系統(tǒng)彌散的氧分子為受精卵的存活提供了充足的氧生存環(huán)境。具有少量血細胞的斑馬魚貧血突變體在其表型可被檢之前可以維持足夠的存活時間。利用斑馬魚模型的特點，我們介紹了以下幾種常用的斑馬魚遺傳學(xué)方法。
　　4.1突變魚體系篩選
　　第一次運用斑馬魚大規(guī)模遺傳學(xué)篩選脊椎動物實驗是在波士頓，馬薩諸塞州進行的。運用肉眼可視的檢查方法對斑馬魚胚胎及早期幼魚進行篩查，為了方便篩選，成年雄性斑馬魚被暴

35、露于乙基亞硝基脲(ENU)，使得斑馬魚生殖細胞（精原細胞）發(fā)生突變，將處理過的雄魚與未處理的正常雌性斑馬魚進行交配，子F1代斑馬魚即為包含了突變體的雜合子，突變率約為200：1。子F1代斑馬魚繼續(xù)與野生型斑馬魚進行雜交，為了挑選攜帶突變基因的雜合子，產(chǎn)生的F2代斑馬魚繼續(xù)雜交。運用該方法獲得的等位基因突變斑馬魚可能會對包括血細胞發(fā)生發(fā)育在內(nèi)的所有解剖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。演變到后來的ENU突變法運用原位雜交技術(shù)對發(fā)生突變的斑馬魚系進行RNA轉(zhuǎn)錄

36、水平的檢測篩選。ENU使新的目標(biāo)基因在轉(zhuǎn)錄水平得到大量的篩選，從而發(fā)揮著對造血，髓系發(fā)育的影響。一旦獲得了新型斑馬魚突變體，那以引起表型改變的基因?qū)欢ㄎ挥诎唏R魚的染色體。從斑馬魚基因組測序完成及斑馬魚基因組庫建立以來，這種定位方法的運用相當(dāng)簡便。運用逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生的插入誘變體在基因組水平發(fā)生了突變，并且可以克隆復(fù)制已發(fā)生損傷的基因。但突變的效率相當(dāng)?shù)?，相?dāng)于化學(xué)誘變率的10％。
　　4.2反義寡聚物嗎啡啉
　　運用mor

37、pholinos技術(shù)可以在斑馬魚目標(biāo)基因RNA水平獲得基因敲除，morpholinos是一段特異的反向RNA寡核苷酸序列。在單胚胎期顯微注射后，它們僅能在體內(nèi)維持1－3天，通過與靶基因翻譯起始位點或剪接位點的結(jié)合，這些小分子化合物抑制了RNA的翻譯及靶序列的剪輯。由于其高特異性及morpholinos分子作用的短暫性，機體內(nèi)顯微注射該分子會產(chǎn)生劑量依賴性毒性作用。Dooley等人運用scl的morpholinos分子敲除了其在機體內(nèi)的表

38、達，導(dǎo)致原始造血和決定性造血的缺失，但是早期血管生成作用不受影響。
　　4.3轉(zhuǎn)基因魚系
　　轉(zhuǎn)基因小鼠模型是遺傳學(xué)實驗方法的主流。對單細胞胚胎期斑馬魚顯微注射DNA載體可以成功獲得轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。哺乳動物廣泛運用的熒光蛋白系統(tǒng)也可同樣運用于斑馬魚，由于胚胎的體外發(fā)育及光學(xué)清晰性，因此熒光蛋白的運用更值得推薦。將熒光蛋白GFP或者DsRed連接到基因或者目標(biāo)啟動子，那么通過對熒光的觀測即可檢測基因的表達。攜帶轉(zhuǎn)基因報告載體的

39、啟動子或者組織特異性啟動子（比如，gata1紅系啟動子）與熒光報告基因連接，然后表達于斑馬魚體內(nèi)，即可產(chǎn)生表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因魚系，通過熒光顯微鏡即可清晰的觀察到細胞系的發(fā)育。為了研究紅系發(fā)育，GFP熒光蛋白被連接在了gata-1啟動子的下游。在胚胎發(fā)育至16hpf時，即可檢測到紅系熒光蛋白GFP的表達。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因魚系來源于幼魚，因為僅1％－5％的顯微注射胚胎能將外源基因整合至胚體基因。組織特異性Rag-1啟動子驅(qū)動的GFP表達可以用

40、來檢測斑馬魚淋巴系的發(fā)育。通過對表達lmo2:DsRed及gata1：GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的熒光檢測，可以完成斑馬魚血管及造血組織的體內(nèi)觀察。目前已證實熒光轉(zhuǎn)基因魚系為原基分布圖的制作和造血干細胞移植實驗提供了有效的動物模型工具，因為新啟動子和新細胞系的發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因魚系的應(yīng)用將會更廣泛。
　　4.4TILLING
　　定向誘導(dǎo)基因組局部突變（Targeted Induced Local Lesions In Genomes）

41、技術(shù)是針對目標(biāo)基因進行高通量篩選突變的反向遺傳學(xué)方法。目前已經(jīng)成功的運用到多物種的定向突變篩選，包括植物，果蠅，秀麗隱桿線蟲，大鼠，小鼠和斑馬魚。同ENU正向遺傳篩選突變類似，TILLING主要為隨機的化學(xué)法誘成年雄魚突變，產(chǎn)生突變的雄魚與野生型雌魚交配產(chǎn)生大批F1代幼魚。然后提取F1代雄魚的基因組DNA建立匹配庫用來篩選，同時冷藏突變的精原樣本以獲得目標(biāo)魚系。另一種方法是從存活的F1代斑馬魚中篩選出tail clip DNA，F(xiàn)1代斑

42、馬魚若干樣本獨立建池，運用巢式PCR技術(shù)F1代DNA，通過測序鑒定目標(biāo)靶基因突變。然后取出已鑒定為目標(biāo)突變的冷藏精原細胞并進行體外受精，從而獲得目標(biāo)型突變體斑馬魚用于實驗研究。運用TILLING技術(shù)已經(jīng)獲得了rag-1基因15種不同的突變體。同一基因不同突變體的獲取，省去了對該基的因的基因敲除研究，且為其下游信號通路及分子的研究提供了更好的模型工具。
　　第二部分 斑馬魚Jak2a V581F載體構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)錄合成
　　目的

43、：對斑馬魚的pGM-T-jak2a wt進行定點突變，完成pGM-T-jak2AV581F全長載體的構(gòu)建，運用T7 RNA聚合酶對含有jak2a基因的ORF區(qū)進行體外轉(zhuǎn)錄，在體外合成5端帶有帽子結(jié)構(gòu)的jak2a mRNA分子,為后續(xù)探討斑馬魚MPD(Myeloproliferative disorders)模型的Jak/Stat信號通路奠定基礎(chǔ)。
　　方法：根據(jù)jak2a基因GeneBank NM_131093序列V581F突變位

44、點的上下游序列片段設(shè)計引物，以pGM-T-jak2 wt質(zhì)粒載體為模板進行PCR后，用DpnⅠ酶對PCR擴增產(chǎn)物進行酶切消化去除模板，然后轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細菌，通過藍白篩選酶切對陽性菌落進行鑒定，小量提取質(zhì)粒，NdeI限制性內(nèi)切酶完成pGM-T-jak2a質(zhì)粒的線性化，運用T7 RNA聚合酶對jak2a基因進行體外轉(zhuǎn)錄及加帽。最后經(jīng)凝膠電泳對目的片段進行鑒定。
　　結(jié)果：完成pGM-T-jak2a V581F的定點突變，成功構(gòu)

45、建pGM-T-jak2aV581F載體，DNA序列分析的結(jié)果與GenBank上的序列（NM_131093）一致，酶切線性化及體外轉(zhuǎn)錄加帽pGM-T-jak2a，凝膠電泳鑒定RNA分子大小與預(yù)期完全一致。
　　結(jié)論：成功完成斑馬魚pGM-T-jak2a V581F基因定點突變并體外轉(zhuǎn)錄及加帽pGM-T-jak2a。
　　第三部分 Jak2a分子在斑馬魚紅系及髓系造血的功能研究
　　目的：初步研究jak2a分子在斑馬魚的時

46、空表達分布情況,通過在斑馬魚體內(nèi)過表達jak2a mRNA分子,研究其對斑馬魚胚胎紅系及髓系的造血影響,為構(gòu)建斑馬魚骨髓增殖性腫瘤(MPN,myeloproliferative neoplasia)模型奠定基礎(chǔ)。
　　方法：根據(jù)斑馬魚jak2a mRNA CDS編碼區(qū)設(shè)計構(gòu)并建合成反義的RNA探針,運用原位雜交技術(shù)及分子生物學(xué)等實驗技術(shù)分析jak2a在斑馬魚體內(nèi)的時空表達情況；通過顯微注射技術(shù)完成斑馬魚體內(nèi)jak2a分子的過表達，

47、并檢測其對紅系及髓系造血的影響。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建jak2a mRNA分子探針,jak2a分子呈母系遺傳；完成其在斑馬魚體內(nèi)的過表達,Real-time PCR及Western blot結(jié)果提示完成jak2a分子斑馬魚體內(nèi)過表達;斑馬魚體內(nèi)過表達jak2a-wild type mRNA分子對紅系及髓系造血具有明顯的促進作用。
　　結(jié)論：jak2a基因在斑馬魚受精卵階段有明顯表達,具有母系遺傳特征,斑馬魚體內(nèi)過表達jak2a