對(duì)斑馬魚(yú)redd1和redd2基因在體功能及其作用機(jī)理的初步研究.pdf

1、REDD1和REDD2都屬于DDIT(DNA Damage Inducible Transcript)或者GADD(Growth Arrest DNA Damage)蛋白家族。目前認(rèn)為這一家族成員參與生長(zhǎng)發(fā)育、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、壓力應(yīng)激、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理病理過(guò)程。REDD1受缺氧、氧化應(yīng)激、饑餓等應(yīng)激狀態(tài)所調(diào)控，通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。REDD1功能異?？蓪?dǎo)致帕金森病、腫瘤和骨骼肌萎縮等疾病。REDD2

2、作為REDD1的相似基因，與REDD1在功能上互補(bǔ)，共同參與mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。
　　 盡管眾多的研究集中在REDD1和REDD2對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)上，但最近的研究也發(fā)現(xiàn)DDIT蛋白家族其他成員還同時(shí)參與了Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，與爪蟾胚胎背腹軸的發(fā)育密切相關(guān)。眾所周知，Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)控制著許多生命過(guò)程，包括生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病、衰老和死亡等；也包括細(xì)胞形態(tài)與功能的分化與維持、免疫、應(yīng)激、細(xì)胞癌變與細(xì)胞凋亡等。經(jīng)

3、典的Wnt信號(hào)通路是Wnt配體通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終穩(wěn)定β-Catenin來(lái)發(fā)揮功能。REDD1和REDD2是否通過(guò)Wnt信號(hào)通路來(lái)調(diào)控胚胎的早期發(fā)育，其機(jī)制如何目前尚不清楚。而且，關(guān)于REDD1和REDD2基因的表達(dá)模式以及其在生理和病理過(guò)程中的作用大多來(lái)自體外細(xì)胞系的結(jié)果，對(duì)于兩者的體內(nèi)時(shí)空表達(dá)方式及其基因調(diào)控方式，尤其是其體內(nèi)基因敲降后的表型研究還相對(duì)較少。
　　 本研究以斑馬魚(yú)為模型，克隆得到了斑馬魚(yú)redd1和red

4、d2基因，對(duì)其時(shí)空表達(dá)方式和基因表達(dá)調(diào)控做了初步研究；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)基因敲降和過(guò)表達(dá)等技術(shù)研究了redd1和redd2與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)系。
　　 結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)redd1位于第12號(hào)染色體上，全長(zhǎng)cDNA含有1，334bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為663bp，編碼220個(gè)氨基酸，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。redd2基因位于第14號(hào)染色體上，全長(zhǎng)cDNA含有1，024bp，ORF為609bp，編碼202個(gè)氨基酸，含有2

5、個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。對(duì)其氨基酸序列比較分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析以及染色體共線性分析表明，斑馬魚(yú)redd1和redd2基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、染色體定位與人類的同源基因相似。Redd1與Redd2蛋白在其羧基末端都含有相似的RTP801 C結(jié)構(gòu)域。在斑馬魚(yú)成魚(yú)不同組織中，redd1 mRNA均有表達(dá)，除了在腮部表達(dá)量較弱，其他組織器官表達(dá)量均較高；而redd2 mRNA僅在肝臟、腎臟和卵巢中的表達(dá)量較高，在其他組織中表達(dá)量較弱。不同發(fā)育時(shí)期胚胎的R

6、T-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，redd1和redd2基因在整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，但在0，2，4 hours postfertilization(hpf)這一階段的表達(dá)量最高。整胚原位雜交方法檢測(cè)兩者的空間表達(dá)方式發(fā)現(xiàn)，redd1 mRNA在剛受精(2hpf)和1000-細(xì)胞時(shí)期的胚胎(4hpf)中普遍表達(dá)，在50％外包時(shí)期(6hpf)，主要集中在生殖環(huán)區(qū)域，即中胚層前體細(xì)胞存在區(qū)域。在體節(jié)形成和隨后的發(fā)育過(guò)程中，主要集中在前脊索神經(jīng)板、尾部中

7、胚層和頭部外胚層等部位；redd2 mRNA在早期沒(méi)有特異信號(hào)，在體節(jié)形成以及隨后的發(fā)育過(guò)程中，特異性表達(dá)在小腦與中腦之間的部位?；虮磉_(dá)調(diào)控方面，熱激和饑餓均能不同程度的上調(diào)胚胎和成魚(yú)體內(nèi)redd1和redd2 mRNA的表達(dá)水平，但兩者的上調(diào)方式不同；缺氧處理(物理缺氧/化學(xué)缺氧)不同發(fā)育時(shí)期的胚胎，僅上調(diào)redd1 mRNA的表達(dá)水平，而redd2 mRNA水平不受缺氧調(diào)控。
　　 進(jìn)一步用基因敲降和過(guò)表達(dá)技術(shù)分析表明，敲

8、降redd1或者redd2基因均能使24hpf胚胎產(chǎn)生背部化表型，即卵黃囊延伸變短變窄，腹部尾鰭缺失以及尾部彎曲；過(guò)表達(dá)Redd1和Redd2均造成24hpf胚胎產(chǎn)生腹部化表型，即頭部和脊索發(fā)育缺陷、尾部體節(jié)膨大。隨后我們檢測(cè)特異性標(biāo)記胚胎背腹軸發(fā)育的基因發(fā)現(xiàn)，兩者敲降均能擴(kuò)大背部探針chd和gsc的表達(dá)范圍而縮小腹部探針evel和ved的表達(dá)范圍；相反，兩者過(guò)表達(dá)能夠縮小背部探針chd和gsc的表達(dá)范圍而擴(kuò)大腹部探針evel和ved的

9、表達(dá)范圍。表明Redd1和Redd2能夠影響胚胎的背腹軸發(fā)育。
　　 近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，DDIT蛋白家族的另一個(gè)成員參與到Wnt信號(hào)通路的調(diào)控，在爪蟾胚胎的背腹軸發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。REDD1和REDD2是否也具有類似的功能目前還不清楚。本研究中，我們檢測(cè)了經(jīng)典Wnt信號(hào)通路下游TCF/LEF報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性。過(guò)表達(dá)斑馬魚(yú)Redd1和Redd2不僅能夠在體內(nèi)顯著拮抗Wnt3a引起的TCF/LEF熒光素酶活性，而且對(duì)于內(nèi)源性的

10、經(jīng)典Wnt信號(hào)通路也有抑制作用。HEK293T細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Redd1和Redd2也能顯著拮抗Wnt3a引起的TCF/LEF熒光素酶活性，表明兩者功能的保守性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，兩者與B-Catenin相互作用。β-Catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的重要作用因子，而β-Catenin△N是β-Catenin持續(xù)激活的突變體。斑馬魚(yú)redd1和redd2mRNA與β-catenin△N共注射均能拮抗β-Catenin△N引起的體軸變長(zhǎng)

11、的背部化表型；體外HEK293T細(xì)胞系中將Redd1和Redd2分別與β-Catenin△N共轉(zhuǎn)染，也能顯著拮抗β-Catenin△N引起的TCF/LEF熒光素酶活性，并且這一抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性，表明兩者對(duì)于經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的抑制作用是在β-Catenin水平上。
　　 以上結(jié)果表明斑馬魚(yú)redd1和redd2是人類REDD1和REDD2的同源基因，它們的結(jié)構(gòu)、時(shí)空表達(dá)方式和基因調(diào)控方式高度保守。本研究首次發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)Re