Stra8基因克隆表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是具有高度未分化、自我更新及分化為包含生殖細(xì)胞在內(nèi)的成體器官及組織的全能性細(xì)胞。研究和利用ESCs是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)及核心問(wèn)題之一。雞胚胎干細(xì)胞(chicken Embryonic Stem Cells，cESCs)是從新鮮雞X期胚盤明區(qū)分離獲得的細(xì)胞，此時(shí)胚盤約有6萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，它們可在體外特定的培養(yǎng)基中保持多能性和全能性，這為研究早期胚胎發(fā)育及分化提供了優(yōu)良的模型。近

2、年來(lái)，已有很多關(guān)于不同方法體外誘導(dǎo)ESCs分化為生殖細(xì)胞的報(bào)道，其中利用視黃酸(Retinoid Acid,RA)進(jìn)行誘導(dǎo)較為常見(jiàn)，這可能是因?yàn)镽A在胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)及細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用，它能直接進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與其受體結(jié)合后作用于靶基因，從而調(diào)控胚胎發(fā)育及組織形成。并且由RA激活的基因Stra8(Stimulated by Retinoid acid Gene8)的表達(dá)是生殖細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂的關(guān)鍵。目前，有關(guān)該基因的研究主要集中在小

3、鼠等模式生物以及人和一些哺乳動(dòng)物方面，對(duì)于禽類該基因的研究較少，且有關(guān)該基因?qū)τ谏臣?xì)胞減數(shù)分裂的作用機(jī)制尚未闡明。
　　本研究采用RT-PCR方法克隆出蘇禽黃雞睪丸組織中Stra8基因序列，生物信息學(xué)分析有關(guān)該基因亞細(xì)胞定位、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Stra8、質(zhì)粒純化后免疫小鼠制備多克隆抗體，采用增強(qiáng)型熒光蛋白(enhanced fluorescentprotein，EGFP)及制備的多

4、克隆抗體驗(yàn)證該基因亞細(xì)胞定位，用RA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-Stra8的雞胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化，采用qRT-PCR及間接免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)過(guò)程中特定基因的表達(dá)變化情況。主要研究結(jié)果如下:
　　克隆蘇禽黃雞Stra8基因的cDNA序列全長(zhǎng)645bp，共編碼214個(gè)氨基酸，其中堿性氨基酸12個(gè)、酸性氨基酸47個(gè)以及60個(gè)疏水性氨基酸和66個(gè)極性氨基酸。將序列提交至GenBank獲得登錄號(hào):JX204292.1。經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)該基因定位于

5、細(xì)胞質(zhì)，蛋白大小為24.3kDa，等電點(diǎn)為4.2，其序列與原雞Stra8的氨基酸序列同源性高達(dá)99％，和火雞的為95％，與斑胸草雀的為76％，和一些靈長(zhǎng)類、哺乳動(dòng)物以及嚙齒類動(dòng)物同一性在40-55％之間，和其他物種的同源性較差，上述結(jié)果說(shuō)明Stra8在禽類中保守性較好。
　　構(gòu)建pEGFP-C1-Stra8及pcDNA3.1(+)-Stra8真核表達(dá)載體，純化質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Stra8免疫小鼠制備Stra8抗體，效價(jià)檢

6、測(cè)結(jié)果為1∶100。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-C1-Stra8轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞及間接免疫熒光進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，Stra8蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符合。通過(guò)提取轉(zhuǎn)染48后細(xì)胞總RNA及蛋白進(jìn)行RT-PCR及Western Blot檢測(cè)重組質(zhì)粒在NIH-3T3細(xì)胞中的整合情況。結(jié)果表明，外源Stra8基因在mRNA水平上發(fā)生轉(zhuǎn)錄，在蛋白水平上發(fā)生融合表達(dá)。上述結(jié)果為建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系及研究禽類Stra8蛋白表達(dá)

7、及其功能發(fā)揮奠定了基礎(chǔ)。
　　采用藥勺法獲取雞X期胚盤，吹散胚盤以1×105/孔接種入24孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。摸索重組質(zhì)粒pEGFP-C1-Stra8轉(zhuǎn)染cESCs的最適用量，并使用G418進(jìn)行篩選，所得細(xì)胞經(jīng)挑克隆及酶消化聯(lián)合法傳代培養(yǎng)。結(jié)果表明，使用1.2μg的質(zhì)粒量可獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)G418篩選2w所得細(xì)胞再用1×10-5mol/L的RA進(jìn)行誘導(dǎo)，并設(shè)置3組對(duì)照。qRT-PCR檢測(cè)Sox2、Dazl、Stra8及integ