Stra8在精子發(fā)生中的表達(dá)研究.pdf

1、維生素A通過其代謝產(chǎn)物視黃酸(retinoic acid，RA)在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用。Stra8(stimulated by retinoic acid gene)是一種能夠被RA特異性誘導(dǎo)活化的基因，其表達(dá)具有發(fā)育階段性，且在生殖腺中特異表達(dá)。Stra8基因敲除雄性小鼠不育，但其在精子發(fā)生中的作用機(jī)制尚未闡明。本課題從Stra8多克隆抗體的制備、Stra8過表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建及Stra8在不同模型小鼠睪丸組織中的表達(dá)三個方面初

2、步探索了Stra8在精子發(fā)生中的表達(dá)情況，為深入研究Stra8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　第一，進(jìn)行了Stra8原核蛋白的表達(dá)，應(yīng)用純化的Stra8蛋白免疫小鼠，獲得了特異性Stra8多克隆抗體。
　　首先通過PCR擴(kuò)增，獲得Stra8開放閱讀框全長基因片段，應(yīng)用分子克隆的方法插入到原核蛋白表達(dá)載體pET28a+中，構(gòu)建了Stra8原核表達(dá)載體pET28a-Stra8。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3) plu

3、s后，用IPTG誘導(dǎo)Stra8原核蛋白表達(dá)，His-Tag柱親和層析純化蛋白，透析復(fù)性，用復(fù)性后的Stra8蛋白為抗原，腹腔注射免疫BalB/C小鼠，獲得了小鼠Stra8多克隆抗體，并分別用ELISA、Westem blot及免疫熒光檢測法證實(shí)所得到的多克隆抗體能夠特異性識別Stra8。
　　第二，應(yīng)用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)Stra8的小鼠精原細(xì)胞株。
　　將Stra8開放閱讀框全長基因片段插入慢病毒載體GV341

4、中，構(gòu)建了慢病毒重組表達(dá)載體GV341-Stra8。然后將GV341-Stra8及兩種輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，收集含慢病毒顆粒的上清，用濃縮后的慢病毒上清感染小鼠精原細(xì)胞系細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后，獲得了穩(wěn)定過表達(dá)Stra8的小鼠精原細(xì)胞株。應(yīng)用Western blot及免疫熒光檢測法對細(xì)胞進(jìn)行Stra8過表達(dá)的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的細(xì)胞株能表達(dá)大量的Stra8蛋白，且Stra8蛋白同時表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，以細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)居

5、多。
　　第三，成功制備了維生素A缺乏（vitaminAdeficient，VAD）雄性小鼠及VAD恢復(fù)雄性小鼠模型，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)分析了Stra8在不同模型小鼠睪丸組織中的表達(dá)情況。
　　用VAD飼料喂養(yǎng)雌雄性小鼠兩周后合籠，新生雄性小鼠VAD飼料喂養(yǎng)13-14周后獲得VAD小鼠。取100天左右VAD小鼠，給予維生素A正常的飲食，維持35天以上即可獲得VAD恢復(fù)模型小鼠。應(yīng)用HE染色法對睪丸組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。在此基礎(chǔ)上

6、選取模型小鼠不同時期睪丸組織，通過Western blot、免疫熒光化學(xué)等方法研究Stra8的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VAD小鼠從VAD飲食第81天起部分生精小管即開始出現(xiàn)生精紊亂，到100天時，生精小管中僅有支持細(xì)胞和少量精原細(xì)胞。VAD小鼠恢復(fù)正常飲食后第9天起，生精小管中初級精母細(xì)胞即開始出現(xiàn)，并逐漸增多，25天時基本可見到各種階段的生精細(xì)胞，至35天時所有生精小管均完全恢復(fù)了正常。對Stra8蛋白的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在VAD小鼠的不同階