豬Stra8基因的克隆、表達(dá)和體外轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞的初步研究.pdf

1、精子發(fā)生的場所在雄性動(dòng)物睪丸的曲細(xì)精管內(nèi)，精子由原始精原干細(xì)胞經(jīng)過復(fù)雜的精子發(fā)生過程而最終形成。這個(gè)過程主要包括三個(gè)階段，首先是精原干細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂大量增殖成為初級精母細(xì)胞。其次，初級精母細(xì)胞啟動(dòng)減數(shù)分裂形成圓形的精子細(xì)胞。最后，精子細(xì)胞通過復(fù)雜的變態(tài)過程形成完整形態(tài)的精子。其中減數(shù)分裂是生殖細(xì)胞特有的方式，是精子發(fā)生過程的重要環(huán)節(jié)。生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的啟動(dòng)與視黃酸(retinoicacid，RA)和其誘導(dǎo)的Stra8(stimulat

2、edbyretinoicacidgene8)基因的表達(dá)密切相關(guān)。視黃酸(retinoicacid，RA)是維生素A在體內(nèi)代謝后的主要活性物質(zhì)。雄性胚胎睪丸的RA活性較低，無Stra8基因的表達(dá)使得雄性生殖細(xì)胞停留在有絲分裂階段。外源的RA能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的雄性生殖細(xì)胞表達(dá)Stra8基因啟動(dòng)減數(shù)分裂。雄性動(dòng)物出生后，Stra8基因的表達(dá)啟動(dòng)雄性生殖細(xì)胞開始減數(shù)分裂，從而進(jìn)入精子發(fā)生的階段。公豬睪丸精原細(xì)胞減數(shù)分裂的啟動(dòng)即意味著首次生精波的

3、啟動(dòng)。不同豬種的精子生成時(shí)間有較大的差異。因此減數(shù)分裂啟動(dòng)時(shí)間的早晚對于種公豬的飼養(yǎng)具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。為了研究Stra8基因在減數(shù)分裂啟動(dòng)的功能，本試驗(yàn)對豬Stra8基因cDNA序列進(jìn)行克隆，并以梅山豬作為試驗(yàn)動(dòng)物，研究其在豬的各個(gè)組織的表達(dá)情況，并構(gòu)建基于EGFP的表達(dá)載體，研究其在精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的功能，結(jié)果如下:
　　 1.Stra8基因cDNA全序列克隆。通過克隆Stra8基因的部分序列，用于設(shè)計(jì)5'RACE和

4、3'RACE的特異性引物，采用PCR方法克隆出Stra8基因的cDNA全序列，將該序列遞交Genbank，序列號為JQ965783，將全長為1444bp的全序列遞交NCBI的ORFFinder，發(fā)現(xiàn)該序列包含147bp的5’端，1101bp的CDS和196bp的3'端，有完整的PolyA尾，但未發(fā)現(xiàn)加尾信號AATAAA。編碼區(qū)編碼367個(gè)氨基酸，Stra8編碼氨基酸一級結(jié)構(gòu)表明該蛋白質(zhì)的相對分子量約為41.04kDa，理論等電點(diǎn)約為4.

5、59。進(jìn)一步對Stra8基因所編碼的氨基酸進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)預(yù)測，通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)在所編碼氨基酸序列第3、4和301氨基酸殘基處存在3個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，第9和116位氨基酸處存在2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)13個(gè)絲氨酸、6個(gè)蘇氨酸和3個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。在NCBI的BlastP搜索與豬Stra8基因編碼氨基酸同源的序列，分析Stra8基因編碼氨基酸與其他動(dòng)物Stra8基因CDS閱讀框的同源性，豬與小鼠的同源性最高達(dá)78.4％，與雞的同源性最

6、低，僅為45.4％。
　　 2.梅山豬Stra8基因時(shí)空表達(dá)譜的構(gòu)建。在mRNA水平上，構(gòu)建Stra8基因的組織表達(dá)譜，Stra8基因是一個(gè)組織特異性表達(dá)的基因，只在公豬的睪丸中表達(dá)，而在腦、下丘腦、垂體、心、肝、脾、肺、腎和卵巢等組織中均無表達(dá)。對不同時(shí)間段梅山豬睪丸組織Stra8基因的表達(dá)量進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示Stra8基因的表達(dá)量隨著梅山豬日齡的變化呈現(xiàn)出上升的趨勢，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Stra8基因在初生、30、60

7、、90及150日齡梅山豬睪丸中睪丸的表達(dá)量分別為0.05、0.16、0.5、0.6和1，并且存在著一定的差異，且在150d表達(dá)量達(dá)到最高。
　　 3.Stra8基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和亞細(xì)胞定位。采用RT-PCR方法，以成年梅山豬睪丸總RNA為模板擴(kuò)增Stra8基因的全長cDNA編碼區(qū)序列，采用TA克隆技術(shù)，將目的片段插入到pMD19-T載體中，重組的質(zhì)粒命名為pMD19-T-Stra8，測序鑒定后，再將其CDS序列插入真核表達(dá)

8、載體pEGFP-N1中，重組質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-Stra8，將其轉(zhuǎn)化到體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞中進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)Stra8蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)無熒光，說明Stra8蛋白屬于細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的蛋白。
　　 4.Stra8轉(zhuǎn)染豬精原干細(xì)胞表達(dá)的初步研究。通過體外培養(yǎng)豬精原干細(xì)胞，將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Stra8轉(zhuǎn)染豬第三代的精原干細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與重組載體轉(zhuǎn)染NIH-3T3的結(jié)果不同的是，該基因所編