雌鼠骨髓干細胞離體表達Oct4、Vasa、Stra8和Scp3的研究.pdf

1、目的： 探索成年雌鼠骨髓干細胞（female bone marrow stem cells，F(xiàn)BMSCs）離體培養(yǎng)條件下是否表達多能干細胞和原始生殖細胞表達的基因Oct4、原始生殖細胞開始分化至減數(shù)分裂后期產(chǎn)生配子的生殖細胞特異表達的標志基因Vasa、以前研究認為僅在雌性胚胎生殖干細胞由有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)闇p數(shù)分裂前表達的標志基因Stra8及減數(shù)分裂標志基因Scp3，判斷FBMSCs是否有向卵母細胞樣細胞分化的能力。 方法：

2、 全骨髓貼壁法分離青年雌性SD大鼠FBMSCs，傳代培養(yǎng)第三代FBMSCs用DMEM+15％胎牛血清培養(yǎng)，全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）組加入終濃度為10-5 Mol/L的ATRA；RT-PCR方法檢測FBMSCs的Oct4、Vasa、Stra8及Scp3 mRNA的表達；Oct4和Stra8基因PCR擴增產(chǎn)物用DNA測序法雙向測定cDNA序列；用免疫細胞化學方法檢測FBMSCs的SCP3

3、蛋白的表達。 結(jié)果： 1.ATRA組部分FBMSCs分化成為大小不一、呈圓形或球形的細胞，分化的大而圓形細胞周圍有數(shù)個小細胞環(huán)繞，對照組FBMSCs細胞比較均一呈長梭形。 2.對照組和ATRA組連續(xù)培養(yǎng)8天都可檢測到早期生殖干細胞標志基因Oct4、Vasa mRNA及生殖干細胞減數(shù)分裂啟動標志基因Stra8 mRNA在誘導分化的FBMSCs中表達。并且Oct4和Stra8基因PCR擴增產(chǎn)物基因測序結(jié)果與基因庫中序

4、列基本一致，Oct4的序列同源性大于99％，Stra8的序列同源性為100％。 3.ATRA組培養(yǎng)第8天開始檢測到生殖細胞減數(shù)分裂標志基因Scp3 mRNA的表達，并于第15天也有表達，但對照組未檢測到Scp3 mRNA表達。 4.免疫細胞化學顯示， ATRA組培養(yǎng)第10、15、29天的FBMSCs部分細胞分化成為中等大小球形或圓形的SCP3陽性細胞，呈簇狀分布，隨著培養(yǎng)時間延長，陽性細胞增多，細胞體積增大。而對照組第1

5、5天開始有少量表達，也隨著培養(yǎng)時間延長，陽性細胞增多，細胞體積增大。 結(jié)論： 1.對照組和ATRA組培養(yǎng)8天內(nèi)均可誘導FBMSCs表達早期生殖干細胞標志Oct4、Vasa mRNA及生殖干細胞由有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)闇p數(shù)分裂前特異表達基因Stra8 mRNA，表明FBMSCs中具有能向卵母細胞分化的多能干細胞，減數(shù)分裂啟動標志基因Stra8不僅在雌性胚胎生殖干細胞表達，也在成年雌性骨髓中的有向生殖干細胞分化能力的細胞中表達，提

6、示成年雌性有新的卵母細胞生成的可能。 2.減數(shù)分裂期特異標志基因Scp3 mRNA只在ATRA誘導的FBMSCs中才有表達。ATRA組培養(yǎng)第8天開始檢測到Scp3 mRNA，并于第15天也有表達，而對照組不表達Scp3 mRNA，可能與本實驗培養(yǎng)條件有限，長期培養(yǎng)細胞數(shù)量明顯減少造成所提取的mRNA的量不足導致檢測不到有關(guān)。 3.ATRA培養(yǎng)可誘導FBMSCs表達生殖細胞減數(shù)分裂期特異標志SCP3蛋白質(zhì)，表明FBMSCs