人Oct4蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞為iPS細(xì)胞的初步研究.pdf

1、多能性干細(xì)胞是一類具有無限自我更新能力及分化為功能細(xì)胞的多潛能特殊細(xì)胞?？茖W(xué)家們通過各種方法希望獲得多能性干細(xì)胞,然而目前方法都存在一定問題。通過4種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)將已分化成體細(xì)胞重編程為多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞),很好的解決了目前存在于多能性干細(xì)胞獲得中的問題。但是iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)方法并不完善,需要解決其安全性和誘導(dǎo)效率方面的問題。本課題通過原核表達(dá)人類Oct4蛋白與細(xì)胞穿膜肽融合蛋白,利用人神經(jīng)干細(xì)胞對單個蛋白誘導(dǎo)iPS細(xì)胞進(jìn)行了探索

2、,主要結(jié)果如下:
　　 (1)利用pET系統(tǒng)構(gòu)建了帶有人類Oct4轉(zhuǎn)錄因子、11-Arginine穿膜肽和6×His純化標(biāo)簽的原核表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含大腸桿菌稀有密碼子的Rostta2(DE3)工程菌以終濃度為1mM的IPTG,28℃12h誘導(dǎo)表達(dá),獲得了43kDa左右的hOct4-11R-His融合蛋白,蛋白處于細(xì)菌裂解上清中。經(jīng)Ni+純化柱純化,經(jīng)Western blotting檢測表明融合蛋白表達(dá)正確。
　　

3、 (2)利用EGFP-11R-His和羅丹明標(biāo)記的hOct4-11R-His蛋白加入BJ和入神經(jīng)干細(xì)胞觀察穿膜肽進(jìn)入細(xì)胞情況。證明蛋白加入量為10ug/ml時穿膜效率高且細(xì)胞狀態(tài)好。hOct4-11R-His蛋白對神經(jīng)干細(xì)胞具有高效的穿膜效率和細(xì)胞核趨向性。
　　 (3)利用hOct4-11R-His誘導(dǎo)人神經(jīng)干細(xì)胞ReNcell NSC,以終濃度為10ug/ml加入細(xì)胞,12h后換液培養(yǎng)4天為一輪,4輪后細(xì)胞出現(xiàn)克隆樣生長。