神經(jīng)細(xì)胞攝取神經(jīng)干細(xì)胞外泌體途徑及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:
　　視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一組基因介導(dǎo)的神經(jīng)退行性視網(wǎng)膜疾病，目前仍沒有有效的治療手段。干細(xì)胞移植是目前最有前景的治療方法之一，但作用機(jī)制仍不清楚，干細(xì)胞/前體細(xì)胞對(duì)損傷組織修復(fù)的機(jī)制仍存在爭(zhēng)論。過去認(rèn)為干細(xì)胞的治療僅僅是通過細(xì)胞替代(cell replacement)發(fā)揮作用，但這一治療機(jī)制由于僅有少部分在移植后期1-2個(gè)月細(xì)胞發(fā)生移行、整合而遭到質(zhì)疑。目前研究認(rèn)為旁分泌效應(yīng)（

2、bystander effects）而非僅是細(xì)胞替代介導(dǎo)了干細(xì)胞的治療作用，而干細(xì)胞分泌的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)可能參與了微環(huán)境調(diào)控和改善，從而發(fā)揮部分治療作用。胞外囊泡(EVs)是細(xì)胞分泌的納米級(jí)膜性囊泡，包含不同類型;主要為外泌體(exosomes，EXOs)、微囊泡(Multi-Vesicles，MVs)，它們?cè)诩?xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前對(duì)于這些囊泡的研究仍存在諸多問題和挑戰(zhàn)，首先

3、何種囊泡參與調(diào)控宿主細(xì)胞及微環(huán)境仍不清楚，其次雖然外泌體和細(xì)胞間的相互作用已經(jīng)證實(shí)，但是外泌體與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合后可能的交流機(jī)制仍缺乏廣泛研究。在本課題中，將重點(diǎn)研究:1.小鼠神經(jīng)干細(xì)胞胞外囊泡兩種提取方法的比較;2.小鼠神經(jīng)干細(xì)胞外泌體在3T3-fGFP細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)吞中的通路機(jī)制。
　　方法:
　　1.用超速離心法獲得胞外囊泡(EV)和Total Exosome Isolation Kit法富集外泌體(EXO);

4、>　　2.形態(tài)學(xué)水平比較兩種樣品（透射電鏡和原子力顯微鏡）;
　　3.蛋白水平比較兩種樣品（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡）;
　　4.脂質(zhì)染料標(biāo)記超速離心法獲得外泌體;
　　5.3T3-fGFP細(xì)胞、原代LE大鼠皮層膠質(zhì)細(xì)胞及原代LE大鼠海馬神經(jīng)元對(duì)C17.2細(xì)胞外泌體攝取方式研究;
　　6.3T3-fGFP細(xì)胞、原代LE大鼠皮層膠質(zhì)細(xì)胞及大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞系oli-neu細(xì)胞攝取C17.2細(xì)胞外泌

5、體通路機(jī)制研究。
　　結(jié)果:
　　一、小鼠神經(jīng)干細(xì)胞胞外囊泡兩種提取方法的比較
　　1.C17.2神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)規(guī)則未出現(xiàn)明顯分化現(xiàn)象，表明所提取囊泡來自小鼠神經(jīng)干細(xì)胞所分泌。
　　2.透射電鏡下EV和EXO均觀察到圓形雙層膜結(jié)構(gòu)和“杯狀”外形的囊泡，與之前文獻(xiàn)報(bào)道一致，直徑分布多集中在300nm以內(nèi)，并且發(fā)現(xiàn)胞外囊泡的平均直徑大于外泌體，提示兩種方法提取的樣品中除外泌體還有體積較大的其他類型囊泡。

6、r>　　3.原子力顯微鏡結(jié)果顯示，EV和EXO的高度分布多集中在2-20nm以內(nèi)，直徑分布多集中在300nm以內(nèi)，并且外泌體的平均高度和平均直徑均大于胞外囊泡，提示超速方法提取的囊泡中從形態(tài)上分析是外泌體和更小囊泡組成的復(fù)合物，且以外泌體為主。
　　4.SDS-PAGE結(jié)果顯示EV和EXO所含蛋白種類、表達(dá)豐度接近。在相同上樣量下HSP70的表達(dá)強(qiáng)度兩者接近，但CD63、CD9和CD81三種蛋白在胞外囊泡中表達(dá)更強(qiáng)，從蛋白水平證明

7、超速離心方法提取的胞外囊泡中外泌體含量較高。
　　二、小鼠神經(jīng)干細(xì)胞外泌體在3T3-fGFP細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中攝取通路研究
　　1.攝取實(shí)驗(yàn)表明3T3-fGFP細(xì)胞、大鼠皮層膠質(zhì)細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞通過內(nèi)吞通路攝取C17.2細(xì)胞外泌體，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核周圍的區(qū)域，并且內(nèi)吞數(shù)量與時(shí)間相關(guān)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加。
　　2.這種內(nèi)吞不僅可以發(fā)生在相同種屬來源的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞之間，也可發(fā)生在不同種屬來源的小

8、鼠神經(jīng)干細(xì)胞與大鼠神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞之間。
　　3.通過藥理實(shí)驗(yàn)確定網(wǎng)格蛋白(Clathrin)介導(dǎo)的內(nèi)吞通路為3T3-fGFP細(xì)胞、大鼠皮層膠質(zhì)細(xì)胞和大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞系oli-neu細(xì)胞內(nèi)吞C17.2細(xì)胞外泌體的重要通路，使用網(wǎng)格蛋白通路抑制劑組內(nèi)吞外泌體的數(shù)量明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1、本實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)和蛋白水平證明使用的超速離心方法獲得的胞外囊泡中主要包含外泌體，更加全面的證實(shí)該方法是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的外泌體收集方法。

9、
　　2、本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)C17.2細(xì)胞來源的外泌體主要是通過內(nèi)吞通路而非融合方式被3T3-fGFP、LE大鼠皮層膠質(zhì)細(xì)胞及LE大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞攝取，且內(nèi)吞數(shù)量的增加呈現(xiàn)時(shí)間相關(guān)。并且這種內(nèi)吞不僅可以發(fā)生在相同種屬來源的神經(jīng)干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間，也可發(fā)生在不同種屬來源的神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞之間。
　　3、本實(shí)驗(yàn)率先提出了3T3-fGFP細(xì)胞、大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞系oli-neur及原代LE大鼠皮層膠質(zhì)細(xì)胞主要通過網(wǎng)格蛋白介