MCMV感染對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化和細(xì)胞周期進(jìn)程的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的: ①在體外細(xì)胞水平研究巨細(xì)胞病毒感染對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）分化的影響及其機(jī)制。 ②探討巨細(xì)胞病毒感染對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Wnt信號(hào)途徑分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。 ③研究巨細(xì)胞病毒感染對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE和細(xì)胞周期進(jìn)程的影響并探討其機(jī)制。 方法: ①小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定和分化潛能的檢測：剖宮取出孕13.5d的BALB/

2、c胎鼠腦組織，制備單細(xì)胞懸液，過濾后用含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；傳4～5代后用nestin免疫熒光鑒定；用添加2％胎牛血清的DMEM/F12分化培養(yǎng)基（不含EGF、bFGF和B27）誘導(dǎo)NSCs分化，7天后采用免疫熒光法檢測（nestin）、神經(jīng)元特異性烯醇酶（NSE）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)。 ② MCMV感染NSCs分化培養(yǎng)模型的建立：用感染復(fù)數(shù)（MOI）分別為5、1和0.1的MCM

3、V感染NSCs，并改用分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。 ③觀察MCMV感染分化培養(yǎng)NSCs形態(tài)學(xué)的變化并示蹤感染過程：采用免疫熒光法分別于分化培養(yǎng)后3d、6d、9d、12d、15d、18d和21d觀察NSCs及其分化細(xì)胞標(biāo)記物nestin、GFAP和NSE表達(dá)的變化，并用MCMV EA示蹤感染過程。 ④ MCMV感染對(duì)NSCs分化細(xì)胞比率的影響：采用流式細(xì)胞術(shù)分別于分化培養(yǎng)后3d、6d和9d檢測NSCs及其分化細(xì)胞比率的變化。

4、 ⑤ MCMV 感染對(duì)NSCs Wnt 信號(hào)途徑分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響：采用Real-time PCR法檢測分化培養(yǎng)后0.5、1、2、3、4和5d時(shí)NSCs Wnt信號(hào)途徑上游基因Wnt-3、Wnt-7a和下游基因Ngn-2、c-myc及CyclinD1 mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化。 ⑥ MCMV感染對(duì)NSCs cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE和細(xì)胞周期進(jìn)程的影響：用感染復(fù)數(shù)（MOI）

5、分別為5、1和0.1的MCMV感染NSCs，并用含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，采用Cyclins/DNA 雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測感染細(xì)胞cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE的表達(dá)和細(xì)胞周期時(shí)相的動(dòng)態(tài)變化。 結(jié)果： ①成功體外分離培養(yǎng)NSCs，NSCs呈球樣生長，神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin表達(dá)陽性，并可進(jìn)一步分化為NF-200陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的星形膠

6、質(zhì)細(xì)胞。 ②分化培養(yǎng)后，感染組NSCs不能貼壁分化生長并逐漸出現(xiàn)腫脹，甚至崩解死亡；細(xì)胞nestin表達(dá)下調(diào)緩慢，顯著高于對(duì)照組，GFAP和NSE表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P<0.05），分化細(xì)胞中可檢測到MCMV EA（早期抗原）的陽性表達(dá)。 ③分化培養(yǎng)后3～9d，感染組Nestin陽性細(xì)胞比率均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而GFAP和NSE陽性細(xì)胞比率顯著低于對(duì)照組（P<0.05），并隨MOI增加差異越明顯。

7、④分化培養(yǎng)后，感染組Wnt-3 mRNA的表達(dá)水平在第1～2d顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05)，其后逐漸升高但未超過正常水平；感染組Wnt–7a和Ngn-2 mRNA水平分別在第0.5～2d和第1d明顯低于正常組（P<0.05)，均至第3d 開始升高，但其總體峰值水平均低于正常組；感染組c-myc mRNA水平在第1～4d顯著低于正常組（P<0.05)；感染組CyclinD1 mRNA水平在第0.5～1d 明顯低于正常組，在第2d（M

8、OI=5）和第3d（MOI=5、1、0.1）高于正常組（P<0.05)；這五種基因表達(dá)變化的幅度隨MOI的增加而增大。 ⑤感染后，NSCs cyclinA、cyclinB1、cyclinD1和cyclinE的表達(dá)均上調(diào)，其中MOI=0.1表達(dá)逐漸上升，在第6d達(dá)峰值，MOI=1組表達(dá)高峰在第4d，MOI=5組表達(dá)高峰在第3d；感染組G0/G1期細(xì)胞比率減少，S期和G2/M期細(xì)胞比率顯著增加，出現(xiàn)S期和G2/M期阻滯，并隨MOI的

9、增加變化越明顯。 結(jié)論： ① MCMV感染可明顯抑制NSCs向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，導(dǎo)致分化細(xì)胞比率減少，分化發(fā)育過程中的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)MCMV易感。 ② MCMV可下調(diào)NSCs Wnt信號(hào)途徑分化相關(guān)基因Wnt-3、Wnt-7a、Ngn-2、c-myc的表達(dá)并干擾CyclinD1基因表達(dá)，這可能是MCMV感染抑制NSCs分化的重要作用機(jī)制。 ③ MCMV抑制NSCs分化的效應(yīng)及對(duì)其Wnt

10、信號(hào)途徑分化相關(guān)基因表達(dá)的影響與MOI大小存在一定量效依賴關(guān)系，MCMV可通過干擾分化相關(guān)基因的表達(dá)來抑制NSCs分化，可能與CMV感染致腦發(fā)育異常密切相關(guān)。 ④ MCMV可上調(diào)cyclinA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE的表達(dá)，誘導(dǎo)NSCs從G0/G1期進(jìn)入S期，出現(xiàn)S期和G2/M期偏移和阻滯，影響NSCs細(xì)胞周期進(jìn)程，并與MOI存在一定量效依賴關(guān)系，這可能是CMV抑制NSCs增殖的主要原因。 ⑤