PRRSV感染對細胞周期的影響及其機制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）的病原，疾病主要特征是母豬流產和仔豬呼吸道疾病。該病在豬群中廣泛傳播，嚴重影響全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，也是豬病防控的一大難題。目前對該病尚無有效的治療手段，在實踐中需采用綜合防治措施

2、才能有效降低或阻斷本病的發(fā)生與傳播。為了減少PRRS造成的不利影響，更好的控制本病，亟待對PRRSV的致病機制進行更深入的了解與研究。
　　在真核細胞中，細胞生長與分裂是以細胞周期的形式進行的。細胞周期檢查點(cellcycle checkpoint)作為負反饋調節(jié)機制，確保了細胞周期事件正確合理運行。當DNA發(fā)生損傷時，這些檢查點被激活發(fā)揮作用，細胞周期運行被阻斷，細胞完成修復保證細胞周期正常運轉，若損傷不能及時修復會導致細胞凋

3、亡。損傷引起的細胞周期停滯激活相關的信號通路，進而影響細胞周期調控蛋白的表達或磷酸化水平發(fā)揮作用的。眾多研究表明，在感染過程中，許多病毒及其相關蛋白可以擾亂細胞周期和誘導細胞凋亡。盡管有關PRRSV致病機制的研究報道已經很多，但PRRSV感染對細胞周期的影響及其機制目前卻鮮有報道。本研究以PRRSV感染MARC-145細胞，探索PRRSV感染對細胞周期的影響及其機制，主要內容如下:
　　1.用PRRSV SD16株感染MARC-1

4、45細胞，在倒置顯微鏡下觀察到明顯的細胞病變，采用IFA和Western blot技術檢測到病毒感染細胞中存在大量的PRRSV N蛋白。
　　2.根據Cell Counting Kit-8（CCK-8）說明，繪制MARC-145細胞數與450 nm吸光度值(OD450nm)的標準曲線并獲得回歸方程“y=0.3098 ln(x)-1.7214，R2=0.998”;以不同感染復數(Multiplicity of Infection，M

5、OI)PRRSV SD16株感染MARC-145細胞，檢測感染后不同時間的OD450nm，根據回歸方程，計算感染后不同時間的細胞數發(fā)現，不同劑量PRRSV SD16株感染MARC-145細胞，均可抑制細胞的增殖，綜合考慮選擇1 MOI感染劑量。
　　3.通過Annexin V-PI雙染發(fā)現，PRRSV感染可誘導MARC-145細胞凋亡，且凋亡細胞數隨著感染時間的延長不斷增加。PI染色和流式細胞術檢測發(fā)現，PRRSV感染可導致MAR

6、C-145細胞周期阻滯在G2/M期。
　　4.IFA和Western blot技術檢測顯示，PRRSV感染引起MARC-145細胞中CyclinB1表達豐度升高且移位于細胞核;Cdc2磷酸化(p-Cdc2)（Tyr15）水平升高且核分布增加;p53總表達量及p-p53(Ser15)的表達均顯著增加;14-3-3σ的表達顯著增加。Western blot及CoIP技術檢測發(fā)現，p21表達顯著升高且p21與Cdc2-CyclinB1復

7、合物之間存在互作。表明PRRSV感染導致的MARC-145細胞周期G2/M期阻滯與p53/p21信號通路活化有關。
　　5.通過qPCR和Western blot技術對轉錄水平及蛋白表達水平分析發(fā)現，PRRSV感染的MARC-145細胞中，Wee1、Myt1轉錄水平差異無統(tǒng)計學意義而蛋白表達水平均增加;Cdc25C表達變化不明顯，但p-Cdc25C(Ser345)表達顯著升高且主要分布于細胞質中;Chk1和p-Chk1(Ser34