reversine對(duì)肝星狀細(xì)胞的細(xì)胞周期、凋亡及其TGF-β通路激活的影響.pdf

1、目的：
　　研究逆轉(zhuǎn)素reversine對(duì)肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells,HSC)的細(xì)胞周期、凋亡及其轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta(TGF-β)通路激活的影響，并探討相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.不同濃度的reversine干預(yù)處理HSC24h，CCK-8法檢測(cè)reversine對(duì)HSC增殖的影響，通過(guò)擬優(yōu)合曲線計(jì)算半數(shù)抑制濃度，即IC50值。
　　2.根據(jù)IC50值選擇5個(gè)濃度（即：0μg

2、/ml,5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml）的reversine進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。顯微鏡下觀察各濃度的reversine干預(yù)HSC24h后的細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。
　　3.Flowcytometry檢測(cè)reversine對(duì)HSC的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.免疫熒光法和westernblot法檢測(cè)HSC中細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p16和極光酶B(AuroraB)蛋白的表達(dá)，檢測(cè)天冬氨酸蛋白水解酶3(caspas

3、e-3)和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)兩個(gè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　5.免疫熒光法和westernblot法檢測(cè)HSC中的I型膠原蛋白（collagen-I）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）及基質(zhì)金屬蛋白酶劑1（TIMP1）的蛋白表達(dá)。
　　6.應(yīng)用外源性生長(zhǎng)因子Tβ1激活HSC，westernblot法檢測(cè)激活的HSC中的平滑肌肌動(dòng)蛋白α（α-SMA）、collagen-I及TGF

4、-β1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.reversine抑制HSC的增殖，抑制率隨著加藥濃度的增加而增加，呈劑量依賴(lài)關(guān)系。通過(guò)擬優(yōu)合曲線計(jì)算IC50值為13.58μg/ml。
　　2.reversine改變HSC形態(tài)，可使細(xì)胞扁平、變圓、皺縮、脫落，連接消失，核質(zhì)濃縮或呈分葉狀，甚至凋亡。
　　3.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)5μg/ml組，10μg/ml組，20μg/ml組及40μg/ml組G2/M期細(xì)胞比例分別為（10.19

5、±3.34）％，（25.87±2.11）%，（28.90±11.0）%及（31.38±1.68）%，隨著reversine濃度增加，HSC停滯于G2//M期的細(xì)胞比例增加。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)5μg/ml組，10μg/ml組，20μg/ml組及40μg/ml組總凋亡率分別為（10.75±1.78）%，（15.38±2.07）%，（20.87±1.51）%及（22.26±1.75）%，早期凋亡率分別為（4.33±0.59）%，（6.38±0.5

6、5）%，（8.25±0.20）%及（8.86±0.49）%；晚期凋亡率分別為（6.42±1.20）%，（9.00±1.52）%，（12.63±1.41）%及（13.40±1.25）%。隨著reversine濃度增加，HSC早期凋亡率、晚期凋亡率以及總凋亡率逐漸增加，呈劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　4.reversine下調(diào)HSC中AuroraB及bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)p16表達(dá)及促進(jìn)caspase-3蛋白的活化。
　　5.reve

7、rsine抑制HSC中collagen-I、TGF-β1、TIMP1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)MMP9蛋白表達(dá)。
　　6.應(yīng)用TGF-β激活HSC后，可以發(fā)現(xiàn)α-SMA、collagen-I、TGF-β1蛋白表達(dá)增加；reversine可下調(diào)激活的HSC中α-SMA、collagen-I、TGF-β1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.reversine可誘導(dǎo)HSC停滯于G2/M期，抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)p16蛋白表達(dá)、抑制Auro