內(nèi)毒素對大鼠原代肝星狀細胞TGF-β1表達的影響及其機制的初步研究.pdf

1、實驗一、大鼠肝星狀細胞分離與培養(yǎng)方法的改良與體會
　　 目的：探討一種經(jīng)濟易行的大鼠肝星狀細胞的分離與培養(yǎng)方法，為今后從細胞及分子水平上研究肝纖維化的發(fā)病機理提供有利條件。
　　 方法：取成年大鼠，用兩步酶液對其肝臟進行離體循環(huán)灌注，經(jīng)兩種密度的Nycodenze密度梯度高速離心(20000r/min)和細胞懸液低速離心(40× g)去雜質(zhì)后得到原代HSCs。臺盼蘭拒染實驗鑒定細胞活率，desmin和GFAP免疫細胞化學

2、雙抗單染色法鑒定剛分離的肝星狀細胞的純度。()-SMA免疫細胞化學AEC顯色鑒定培養(yǎng)7天的細胞活化程度。
　　 結(jié)果：HSCs的得率為(3.6±0.1)×107/肝，HSCs存活率為(92.8±0.8)％，對培養(yǎng)24小時的HSCs行desmin和GFAP共同鑒定DAB顯色，細胞陽性率為(96.2±0.5)％；取培養(yǎng)7天的細胞爬片做()-SMA做HSCs的活化鑒定AEC顯色，細胞陽性率為(72.3±0.6)％。
　　 結(jié)論

3、：改良法在保障大鼠原代HSCs產(chǎn)量的前提下提高了細胞純度，有利于對原代大鼠HSCs生物學特性及肝纖維化機制的進一步研究。
　　 實驗二、內(nèi)毒素對大鼠原代肝星狀細胞TGF-β1表達的影響及其機制的初步研究
　　 目的：觀察內(nèi)毒素刺激大鼠原代HSCs后TGF-β1表達的影響，探討PDTC(NF-κB抑制劑)改善肝纖維化的機制。
　　 方法：用鏈酶蛋白酶液和膠原酶液離體灌注消化健康成年大鼠肝臟，Nycodenze密度梯

4、度離心，得到原代HSCs，在含有內(nèi)毒素終濃度分別為0.01、0.1、1、10μg/m1的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，各濃度組分別在培養(yǎng)第2、4、8天時收集細胞培養(yǎng)上清液，-20℃保存，Elisa法測定TGF-β1含量。在含有各濃度內(nèi)毒素的培養(yǎng)液中分別在第2、4、8天換成含PDTC終濃度為10μmol/L且含有原濃度內(nèi)毒素的培養(yǎng)液，對照組在第2、4、8天時換成只含有原濃度內(nèi)毒素未加PDTC的培養(yǎng)液，48小時后，收集細胞培養(yǎng)上清液-20℃保存，Elisa

5、法測定TGF-β1含量。
　　 結(jié)果：內(nèi)毒素直接刺激HSCs，分別在第2、4、8天測得的TGF-β1含量均高于對照組，且1μg/ml組TGF-β1的表達升高最多，其次為0.1μg/ml組，10μg/ml組和0.01μg/ml組。加入PDTC后，各組TGF-β1的表達量均低于對照組。
　　 結(jié)論：一定濃度的內(nèi)毒素直接作用原代HSCs使其TGF-β1表達增加，提示內(nèi)毒素可直接引起HSCs的活化，這可能是內(nèi)毒素促進肝纖維化的途