microRNA-200a抑制TGF-β1誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞增殖作用的機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)通常是由體內(nèi)外多種刺激因素,如酒精、肝毒物、酶催化劑及過(guò)敏原性物質(zhì)等共同作用于肝臟所引起的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過(guò)度沉積的病變過(guò)程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellates cell,HSC)的活化作為肝纖維化形成和發(fā)展的中心環(huán)節(jié),可受到多條信號(hào)通路及細(xì)胞因子的影響,如 Wnt/β-catenin通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)介導(dǎo)的T

2、GF-β/Smad通路等。此外,除了受到傳統(tǒng)信號(hào)通路的影響外,近年來(lái)發(fā)現(xiàn),HSC的活化還可受到microRNA(miRNA)的調(diào)控。miRNA作為繼轉(zhuǎn)錄因子外,參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的另一類新興因子,在細(xì)胞的發(fā)育、分化、代謝及細(xì)胞信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列生命活動(dòng)中均產(chǎn)生了重要作用。其中,miR-200a在癌癥及纖維化疾病中逐漸顯示出的多重效應(yīng)引起了研究人員的普遍關(guān)注。但miR-200a是否以及如何參與 TGFβ和Wnt/β-catenin通路在

3、HSC的活化則鮮有報(bào)道。本課題通過(guò)研究miR-200a在大鼠病理性肝纖維化組織及活化的HSC中的表達(dá)變化,在分子水平上,深刻探討其對(duì)TGFβ和Wnt/β-catenin通路的影響,以揭示miR-200a介導(dǎo)HSC活化的新的作用機(jī)制。
　　本研究按照正常組10只、CCl4模型組15只的標(biāo)準(zhǔn)將雄性Sprague Dawley大鼠分為兩組。自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后,模型組大鼠給予1ml/kg50％CCl4植物油溶液皮下注射建立肝纖維化模型,每周2次

4、,總計(jì)12周;正常組給予同劑量油溶液皮下注射。12周造模結(jié)束后,取肝組織進(jìn)行H&E及Masson膠原染色檢測(cè),并采用免疫組化法測(cè)出α-SMA在大鼠肝組織中的表達(dá)變化。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CCl4模型組大鼠肝纖維化組織及在不同濃度、時(shí)間點(diǎn)TGF-β1刺激的HSC中miR-200a的表達(dá)。通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-200a mimics(模擬物)至肝星狀細(xì)胞內(nèi)以觀察miR-200a對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HS

5、C活化的影響,采用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)于體外培養(yǎng)的大鼠 HSC,轉(zhuǎn)染不同濃度的miR-200a mimics(60nM,80nM,100nM),4-6 h后用5ng/ml TGF-β1刺激細(xì)胞24 h或48 h,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法,流式細(xì)胞術(shù)觀察 miR-200a對(duì) TGF-β1誘導(dǎo)的HSC的增殖、周期、凋亡的影響。運(yùn)用生物數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出miR-200a的潛在性功能靶點(diǎn):轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)和β-鏈

6、蛋白(β-catenin)。利用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證這一預(yù)測(cè)并采用PCR及Western blots等技術(shù),分別檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC中α-SMA,TGF-β2,β-catenin mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn),在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,與正常組相比,miR-200a在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化組織中,其表達(dá)是降低的。在體外實(shí)驗(yàn)中,用不同濃度(0,5,10,15 ng/ml)的TGF-β1,以及在不同時(shí)間點(diǎn)(0,6,

7、24,48 h)用同一濃度的TGF-β1(5ng/ml)分別刺激 HSC,miR-200a的表達(dá)呈現(xiàn)出劑量-時(shí)間依賴性下調(diào)趨勢(shì)。與陰性對(duì)照組相比,不同濃度的miR-200a mimics(60nM,80nM,100nM)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入HSC,可以顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA的表達(dá)水平。過(guò)表達(dá)miR-200a可以明顯抑制TGF-β1刺激的HSC的增殖及活化,但并未增加細(xì)胞的凋亡。此外,采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)了TGF-β2和β-c

8、atenin是miR-200a的功能性靶點(diǎn)。在TGF-β1刺激活化的HSC中,miR-200a可以顯著降低TGF-β2的mRNA及蛋白水平表達(dá),但對(duì)于其另一個(gè)靶點(diǎn)β-catenin,miR-200a只能降低其蛋白水平表達(dá),對(duì)其mRNA水平則不產(chǎn)生影響。以上研究提示,miR-200a對(duì)TGF-β2及β-catenin二者的作用方式存在差異,miR-200a可通過(guò)影響不同靶蛋白(TGF-β2,β-catenin)的表達(dá),參與調(diào)控TGF-β及