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文檔簡介
1、目的:探討牛蒡子苷元(ATG)對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的防治作用及抑制血小板源性衍生因子BB(PDGF-BB)刺激的肝星狀細(xì)胞(HSCs)增殖的分子機(jī)制。
方法:復(fù)制大鼠CCl4肝纖維化模型,造模8周。從第5周開始,給予ATG和秋水仙堿(colchicine,COL),連續(xù)治療4周。測定各組大鼠血清中肝功能指標(biāo)和肝纖維化標(biāo)志物水平,肝組織中羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)的含量;HE和 Mass
2、on染色觀察肝組織病理學(xué)改變,免疫組織化學(xué)法分析肝組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)情況,并采用組織免疫熒光雙標(biāo)法檢測活化的肝星狀細(xì)胞增殖狀況,免疫印跡法測定細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)水平。采用BrdU摻入的ELISA法,檢測ATG對(duì)活化的HSC細(xì)胞增殖的抑制效果,并使用流式細(xì)胞術(shù)分析ATG對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響,免疫印跡法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;通過免疫共沉淀技術(shù)獲得 Cyclins-CDKs免疫復(fù)合物,并分別以組蛋白H1(histone
3、 H1)和細(xì)菌合成的GST-Rb融合蛋白為底物,分別檢測細(xì)胞周期素依賴的蛋白激酶CDK2和CDK4/6激酶復(fù)合物的活性;通過特異性的p21cip1和p27kip1抗體,將與p21cip1和p27kip1結(jié)合的CDKs-CKIs免疫復(fù)合物從全細(xì)胞裂解液中進(jìn)行分離后,考察p21cip1和p27kip1與CDK2、CDK4、CDK6的相互結(jié)合情況;為證實(shí)ATG所介導(dǎo)的G0/G1周期停滯和HSCs增殖抑制作用,與其上調(diào)p27kip1蛋白表達(dá)水平
4、有關(guān),采用siRNA技術(shù),特異性地沉默p27kip1基因表達(dá)后,同時(shí)檢測其對(duì)ATG誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞增殖抑制作用的影響;通過檢測位于PDGFR下游的FOXOs的磷酸化水平、FOXO3a和14-3-3復(fù)合物形成以及FOXO3a入核情況,考察ATG對(duì)PDGF調(diào)控的下游信號(hào)分子的影響,探索ATG上調(diào)細(xì)胞周期阻抑物蛋白p27kip1表達(dá)的信號(hào)調(diào)控通路;采用siRNA技術(shù),特異性沉默F(xiàn)OXO3a基因表達(dá),檢測其對(duì)ATG誘導(dǎo)上調(diào)的p27kip
5、1表達(dá)水平的影響。
結(jié)果:研究ATG對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的治療作用,結(jié)果顯示,給予ATG(1、3mg/kg)和COL(0.1 mg/kg)均能顯著降低血清中升高的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)、層粘連蛋
6、白(laminin,LN)以及Ⅲ型前膠原(procollagenⅢ,PCⅢ)水平,升高白蛋白(albumin,ALB)濃度,病理組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),ATG能明顯減輕肝臟纖維化程度,降低肝組織中Hyp含量。同時(shí),ATG還能降低肝臟組織中活化肝星狀細(xì)胞的數(shù)量,同時(shí)降低cyclin D1、CDK2/4及細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA蛋白的表達(dá)水平,上調(diào)細(xì)胞周期阻抑物蛋白p27kip1的表達(dá)。通過觀察ATG對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)激活的HSCs抑制增殖作用及其
7、相關(guān)作用機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在無細(xì)胞毒作用濃度下,ATG可抑制PDGF激活的HSCs增殖和DNA合成,將HSCs的細(xì)胞周期阻止在G0/G1期,在G1期早期,ATG通過下調(diào)cyclinD1、CDK4/6表達(dá)水平,顯著抑制細(xì)胞周期素依賴性激酶CDK4/6的活性。同時(shí),在G1/S轉(zhuǎn)換期,ATG還能顯著上調(diào)細(xì)胞周期抑制物蛋白p27kip1的表達(dá)和CDK2-p27kip1復(fù)合體的形成,從而抑制CDK2的活性,實(shí)現(xiàn)對(duì)HSCs G0/G1細(xì)胞周期的全面阻
8、滯作用。此外,通過p27kip1基因沉默方法,降低ATG誘導(dǎo)下的p27kip1基因表達(dá)水平,可以同時(shí)消除由ATG誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞增殖抑制作用,證實(shí)了ATG對(duì)HSCs周期阻滯和增殖抑制作用,主要通過上調(diào)p27kip1基因表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)。在PDGF-BB激活的HSCs中,ATG抑制了HSCs中Akt及下游轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a的磷酸化水平,同時(shí)降低FOXO3a與14-3-3蛋白的結(jié)合能力,誘導(dǎo)FOXO3a的核轉(zhuǎn)位能力;此外,通過RNA
9、干擾技術(shù),特異性地沉默F(xiàn)OXO3a基因表達(dá)水平,可以明顯降低ATG介導(dǎo)的p27kip1蛋白表達(dá)水平。
結(jié)論:ATG對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和肝纖維化具有顯著的治療作用,其作用機(jī)制可能通過阻抑 PI3K/Akt蛋白激酶的磷酸化激活,阻斷其下游調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a的磷酸化,進(jìn)而誘導(dǎo)FOXO3a發(fā)生核轉(zhuǎn)移,并上調(diào)p27kip1蛋白表達(dá)水平,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CDK2激酶活性的抑制,使HSCs無法完成從G1期向S期的轉(zhuǎn)變,發(fā)揮抑制活化
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