Sorafenib對(duì)大鼠肝纖維化及肝星狀細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、肝纖維化(liver fibrosis)是對(duì)包括病毒、自身免疫、藥物、酒精、膽汁淤積以及代謝疾病在內(nèi)的各種病因所致的慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng),是一種以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的過(guò)度沉積為特征的病理生理過(guò)程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié),活化的HSC是以Ⅰ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源,在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中起重要作用。
　　 各種致

2、病因素作用于肝臟使靜止的HSC激活轉(zhuǎn)化為具有成纖維和收縮作用的肌纖維母細(xì)胞,在形態(tài)學(xué)上由靜止的貯存維生素A的儲(chǔ)脂細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)細(xì)胞骨架蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的活化的HSC,并不斷增殖,持續(xù)活化而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。已有多項(xiàng)研究證實(shí)在急慢性肝損傷動(dòng)物模型中,肝纖維化的逆轉(zhuǎn)伴隨著HSC增殖的減少和HSC凋亡的增多,因而抑制HSC增殖、誘導(dǎo)HSC凋亡成為治療肝纖維化的關(guān)鍵。
　　

3、 本課題旨在研究口服sorafenib對(duì)兩種肝纖維化模型-膽總管結(jié)扎(bile duct ligation,BDL)和二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)誘導(dǎo)的肝纖維化的影響及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;sorafenib對(duì)鼠HSC株T6和人HSC株LX2以及大鼠原代HSC增殖和凋亡的作用及可能的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)由以下四部分組成:
　　 第一部分:口服sorafenib對(duì)大鼠肝纖維化的影響及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　

4、 目的:研究口服不同劑量sorafenib對(duì)BDL和DMM誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的治療作用。
　　 方法:運(yùn)用BDL方法和DMN腹腔注射兩種方法建立大鼠肝纖維化模型,治療組于模型建立第3周、第4周分兩個(gè)劑量(BDL:20mg/kg,40mg/kg;DMN:1mg/kg,5mg/kg)干預(yù)動(dòng)物,假手術(shù)組與治療組均于第4周取材,模型組分別于模型建立1 wk、2 wk、3 wk、4 wk取材。組織切片經(jīng)HE和Masson三色染色檢測(cè)模型建

5、立過(guò)程中的動(dòng)態(tài)病理變化及治療后病理改變,利用病理圖像分析軟件測(cè)定肝組織Masson染色膠原面密度;測(cè)定血清ALT、AST、膽紅素及白蛋白含量;Western Blot檢測(cè)ERK、phospho-ERK、Akt、phospho-Akt、p70S6K、phospho-p70S6K在肝組織的表達(dá);免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)phospho-ERK、phospho-Akt、phospho-p70S6K及α-SMA的表達(dá)。
　　 結(jié)論:soraf

6、enib能夠緩解BDL和DMN誘導(dǎo)的肝纖維化程度,這種治療作用是通過(guò)抑制ERK和Akt/p70S6K信號(hào)通路的活化繼而減少HSC的激活和ECM的沉積實(shí)現(xiàn)的。
　　 第二部分:Sorafenib抑制肝星狀細(xì)胞增殖及其對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控
　　 目的:研究sorafenib對(duì)HSC增殖和細(xì)胞周期的影響。
　　 方法:采用原位循環(huán)灌流和密度梯度離心技術(shù)分離大鼠原代HSC,熒光顯微鏡觀察剛分離靜止的原代HSCs,應(yīng)用單克隆抗

7、體α-SMA行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定活化的原代HSC。Sorafenib不同濃度(2.5μmol/L,5.0μmol/L,10.0μmol/L)和時(shí)間點(diǎn)(12 h,24 h,48 h,72 h、)干預(yù)鼠PDGF活化的HSC株T6和人HSC株LX2以及原代HSC,四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyl tetrazolium,MTF)比色法檢測(cè)細(xì)胞活力變化、[3H]標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷([3H]-Thymidine,[3H]-Td

8、R)摻入法測(cè)定細(xì)胞DNA合成;流式細(xì)胞學(xué)分析細(xì)胞周期變化;Western Blot檢測(cè)Cyclin-D1和Cdk-4的表達(dá)。
　　 結(jié)論:Sorafenib能夠抑制HSC增殖,這種作用抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin-D1和Cdk-4的表達(dá),調(diào)控細(xì)胞周期停滯于S期有關(guān)。
　　 第三部分:Sorafenib促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡
　　 目的:研究sorafenib對(duì)HSC凋亡以及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響。
　　

9、方法:Sorafenib(2.5μmol/L,5.0μmol/L,10.0μmol/L)干預(yù)HSC-T6和LX2細(xì)胞株12 h或24 h。透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;膜聯(lián)蛋白(Annexin-v)/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)聯(lián)合標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC凋亡率;末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記(terminal deoxynucleotidy transferrase UTP-nick end

10、labeling,TUNEL)檢測(cè)HSC凋亡。Sorafenib(2.5μmol/L,5.0μmol/L,10.0μmol/L)預(yù)處理HSC2h后,干預(yù)PDGF刺激的T6和LX2細(xì)胞共24 h。測(cè)定Caspase-3活性;RT-real time PCR測(cè)定Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá);Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、Fas、Fas-L以及Caspase-3蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:Sor

11、afenib能夠誘導(dǎo)HSC凋亡,這種作用與抑制Bcl-2、提高Bax、Fas、Fas-L表達(dá)和Caspase-3的活性有關(guān)。
　　 第四部分:Sorafenib對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　 目的:研究sorafenib對(duì)HSC細(xì)胞內(nèi)MAPK/ERK以及AkVp70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:不同濃度sorafenib(2.5μmol/L,5.0μmol/L,10μmol/L)干預(yù)

12、PDGF-BB(20 ng/ml)刺激的HSC-T6和LX2細(xì)胞株,或不經(jīng)PDGF刺激直接以sorafenib干預(yù)共24 h,Western blot檢測(cè)ERK、Akt、p70S6K、p-ERK、p-Akt和p-p70S6K的蛋白表達(dá)變化。以10μmol/L sorafenib、25μmol/LLY294002和50μmol/L PD98059同時(shí)干預(yù)經(jīng)或不經(jīng)PDGF-BB(20 ng/ml)刺激的HSC-T6和LX2細(xì)胞株,橫向比較s