蘄艾提取液對肝纖維化大鼠細胞外基質(zhì)及肝星狀細胞的影響.pdf

1、研究背景：肝纖維化(HF)是慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，是形成肝硬化的必經(jīng)病理階段，其實質(zhì)在于細胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積。肝星狀細胞(HSC)的激活增殖是引起肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，阻抑激活的HSC活化、增殖及促進HSC凋亡是治療肝纖維化的重要途徑。TGFβ1-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)湖北省的道地藥材-蘄艾有明顯的抗肝纖維化的作用，為進一步研究該藥的抗肝纖維化作用機制，本研究擬對蘄艾提取液對

2、肝纖維化大鼠細胞外基質(zhì)及肝星狀細胞的影響進行探討。
　　 目的：本實驗以異種血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化大鼠模型為研究對象，觀察道地中藥材制劑蘄艾提取液對肝纖維化大鼠細胞外基質(zhì)的影響；通過研究蘄艾提取液藥物血清對大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)增殖、凋亡及對TGFβ1-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，從分子生物學(xué)水平闡明蘄艾提取液抗纖維化作用的機制。
　　 方法：
　　 (一)蘄艾提取液對肝纖維化大鼠細胞外基質(zhì)的影響：Wi

3、star大鼠60只隨機分為正常對照組、模型組和高、中、小劑量蘄艾提取液治療組，采用異種血清腹腔內(nèi)注射構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，HE染色后，光鏡下觀察大鼠肝組織纖維化程度；SABC型免疫組化染色法觀察肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)含量變化，并對免疫組化檢測結(jié)果進行圖像分析。
　　 (二)蘄艾提取液對大鼠肝星狀細胞的影響：
　　 1.蘄艾提取液藥物血清對大鼠肝星狀細胞增殖的影響及機制：傳代培養(yǎng)的大

4、鼠肝星狀細胞HSC-T6與蘄艾提取液藥物血清(5％、10％、20％)共同培養(yǎng)24小時后，采用MTT法檢測細胞增殖、流式細胞儀檢測細胞周期及Western-blot、實時熒光定量RT-PCR檢測Cyclin D1蛋白及其mRNA的表達。
　　 2.蘄艾提取液藥物血清對大鼠肝星狀細胞凋亡的影響及機制：采用Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細胞儀檢測HSC-T6凋亡及Western-blot、實時熒光定量RT-PCR檢測抗凋亡基因B

5、cl-2 mRNA及蛋白的表達。
　　 3.蘄艾提取液藥物血清對大鼠肝星狀細胞TGFβ1-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響：Elisa檢測TGFβ1蛋白表達、Wes tern-blot及實時熒光定量RT-PCR檢測TGFβ1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白及其mRNA表達。
　　 [結(jié)果]
　　 1.在細胞外基質(zhì)方面：蘄艾提取液各治療組與同期模型組相比，肝纖維化程度明顯減輕。肝纖維化模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原及TIMP

6、-1含量比正常對照組明顯增加(P＜0.01)，蘄艾口服液各治療組Ⅰ、Ⅲ型膠原及TIMP-1含量比模型組明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 2.在細胞增殖方面：不同濃度蘄艾提取液藥物血清(5％、10％、20％)與空白對照組及生理鹽水血清各組比較，均能顯著抑制HSC-T6增殖(P＜0.01)，其抑制作用呈濃度依賴關(guān)系。流式細胞儀分析顯示，蘄艾提取液藥物血清組G0/G1期細胞顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，而S期細

7、胞顯著下降(P＜0，05，P＜0.01)，但對于G2期無影響。細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)。同時蘄艾提取液藥物血清可明顯抑制cyclin D1 mRNA及其蛋白表達(P＜0.01)，而且隨血清濃度的增加，抑制作用增強，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
　　 3.在細胞凋亡方面：蘄艾提取液藥物血清組HSC-T6早期細胞凋亡率顯著高于空白對照組及生理鹽水血清組(P＜0.01)，并且隨著血清濃度的增加，HSC-T6早期細胞凋亡率

8、逐漸增高，呈劑量依賴關(guān)系。同時蘄艾提取液藥物血清組可下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 mRNA及蛋白表達(P＜0.05，P＜0.01)，而且隨血清濃度的增加，Bcl-2 mRNA及其蛋白表達降低，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
　　 4.在細胞TGFβ1-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面：與空白對照組及生理鹽水血清組相比，蘄艾提取液藥物血清可顯著抑制HSC TGFβ1、Smad3、Smad4蛋白及其mRNA表達(P＜0.05，P＜0.01)，上調(diào)Smad7

9、蛋白及其mRNA表達(P＜0.05，P＜0.01)，而且隨藥物血清濃度的增高對HSC-T6 TGFβ1、Smad3、Smad4蛋白及其mRNA表達的抑制程度逐漸增強，而Smad7蛋白及其mRNA表達逐漸升高，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1.蘄艾提取液能夠下調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原及TIMP-1mRNA表達，減少肝內(nèi)膠原物質(zhì)的過度沉積。
　　 2.蘄艾提取液藥物血清能夠抑制HSC增殖，促進HSC的凋亡。