靶向肝星狀細胞PDGF-β受體小干擾RNA減輕大鼠肝纖維化.pdf

1、目的：RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種介導轉(zhuǎn)錄后基因沉默的強大工具。它是通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)降解生物體或細胞內(nèi)同源mRNA,導致序列特異性同源基因沉默,使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的過程。本研究應用RNAi技術(shù)沉默PDGFR-β表達,阻斷PDGF的作用,觀察在體外對HSC生物學特性及大鼠實驗性肝纖維化的影響；并構(gòu)建膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibri

2、llary acidic protein,GFAP)基因啟動子介導的PDGFR-β siRNA表達載體,觀察其靶向治療大鼠實驗性肝纖維化的療效。 方法： 1、篩選高效沉默PDGFR-β基因表達的siRNA設(shè)計3對針對大鼠PDGFR-β mRNA開放閱讀框的siRNA分子,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞,RT-PCR法和Western Blot法檢測HSC-T6中PDGFR-βmRNA和蛋白的表達,篩選高效沉

3、默PDGFR-β基因表達的siRNA。 2、siRNA干擾PDGFR-β表達對HSC-T6生物學特性的影響PDGFR-β siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6后進行PDGF-BB刺激,48小時后收集細胞,用RT-PCR法檢測細胞中與纖維化相關(guān)的基因表達變化；用BrdU摻入試驗檢測細胞增殖能力的變化；用Annexin IV/PI染色法檢測凋亡細胞數(shù)目的變化；用Western Blot檢測ERK的磷酸化水平,RT-PCR檢測c-fos的表達水

4、平來觀察PDGFR-β siRNA對HSC細胞內(nèi)MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的影響。 3、構(gòu)建表達PDGFR-β siRNA的質(zhì)粒載體siRNA分子在體內(nèi)具有半衰期短、不穩(wěn)定等缺點,為了觀察PDGFR-β siRNA在體內(nèi)對動物實驗性肝纖維化的影響,我們將PDGFR-β siRNA對應的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)插入商品化質(zhì)粒pCMR30的miR30結(jié)構(gòu)中,構(gòu)建表達PDGFR-β shRNA的質(zhì)粒載體

5、(pCMV-shRNA-LacZ),以CMV基因啟動子啟動下游PDGFR-βshRNA的表達,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)基因作為報告基因。另外構(gòu)建陰性對照質(zhì)粒(pCMV-NC-LacZ),以CMV基因啟動子啟動下游對PDGFR-β基因無干擾作用的小RNA的表達。 4、pCMV-shRNA-LacZ對動物實驗性肝纖維化的影響構(gòu)建膽總管結(jié)扎(bile duct ligation,BDL)和二甲基亞硝

6、胺(dimethylnitrosamine, DMN)大鼠肝纖維化模型,將pCMV-shRNA-LacZ和pCMV-NC-LaeZ質(zhì)粒在造模前1天通過尾靜脈高壓注射至大鼠體內(nèi)。為了保證PDGFR-β shRNA在大鼠體內(nèi)的穩(wěn)定表達,以后每5天重新注射一次。造模結(jié)束后取血檢測血清肝功能,取肝組織用免疫組化法和Western Blot方法檢測α平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和PDGFR-β蛋白表達水

7、平,用HE染色和Masson三色染色法觀察肝臟的病理變化。 5、構(gòu)建含膠質(zhì)纖維酸性蛋白基因啟動子的PDGFR-β shRNA質(zhì)粒表達載體質(zhì)粒pGfa2-elae包含人的GFAP基因啟動子。用PCR克隆的方法將pGfa2-elae中的GFAP基因啟動子克隆出來,插入pCMV-shRNA-LacZ的酶切位點之間,取代CMV基因啟動子,命名為pGfa-shRNA-LacZ。同理構(gòu)建陰性對照質(zhì)粒,命名為pGfa-NC-LacZ。

8、 6、體內(nèi)驗證pGfa-shRNA-LaeZ的HSC靶向性由于在正常肝臟中HSC的數(shù)量較少,為了增加肝臟中HSC的數(shù)目以便于我們觀察,我們用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)腹腔內(nèi)注射制備大鼠急性肝損傷模型,用BDL方法制備大鼠慢性肝損傷模型。將pGfa-shRNA-LaeZ和pCMV-shRNA-LacZ分別通過尾靜脈高壓注射入模型大鼠體內(nèi),24小時后處死小鼠,取肝組織用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢

9、測表達β-gal的細胞在兩種模型大鼠肝組織中的分布,并觀察肝臟中β-gaJ蛋白和GFAP蛋白、β-gal蛋白和α-SMA蛋白的細胞共定位情況。 7、pGfa-shRNA-LaeZ對大鼠實驗性肝纖維化的影響構(gòu)建BDL大鼠肝纖維化模型,將構(gòu)建好的pGfa-shRNA-LacZ及其相應的陰性對照質(zhì)粒pGfa-NC-LacZ在造模前1天通過尾靜脈高壓注射至各組大鼠體內(nèi)。造模結(jié)束后取血檢測血清肝功能,取肝組織用免疫組化法檢測α-SMA和P

10、DGFR-β蛋白表達水平,用HE染色和Masson三色染色法觀察肝臟的病理變化,測定組織羥脯氨酸含量來定量評價PDGFR-β shRNA對大鼠肝纖維化的影響。 結(jié)果： 1、針對PDGFR-β基因957位點的siRNA能高效沉默靶基因的表達我們合成了針對PDGFR-β基因不同位點的小干擾RNA及其陰性對照RNA,分別命名為PDGFR-β siRNA2597、PDGFR-β siRNA2687、PDGFR-β siRNA95

11、7和PDGFR-βsiRNAcon。RT-PCR結(jié)果顯示三對siRNA均能不同程度抑制PDGFR-β mRNA的表達,其中以PDGFR-β siRNA957的基因沉默效率最高,達到(72±4.20)％,且轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞72小時的基因沉默效率明顯高于轉(zhuǎn)染24(40±3.14)％和48小時(55±4.67)％,Western Blot檢測顯示PDGFR-β siRNA957轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞72小時后PDGFR-β蛋白水平降低約(6

12、0±7.59)％。以后的實驗均用PDGFR-β siRNA957進行。 2、PDGFR-β siRNA能抑制HSC-T6細胞的活化和膠原合成RT-PCR和Western Blot結(jié)果表明PDGF-BB能提高HSC-T6細胞的活化水平,使α-SMA的基因表達水平升高,而PDGFR-β siRNA能抑制PDGF-BB的這種效應,使α-SMA的基因表達水平降低約(50±2.20)％：此外,RT-PCR結(jié)果還提示PDGF-BB能明顯促進

13、HSC-T6 PDGF-B鏈、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1,TIMP-1)和I型膠原基因表達,而PDGFR-β siRNA能使PDGF-B、CTGF、TIMP-1和I型膠原基因表達分別下降約(43±3.40)％、(50±5.10)％、(45±1.80)％和(40±2.

14、40)％。但無論是PDGF-BB還是PDGFR-β siRNA對轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinases-2,MMP-2)的基因表達均無明顯影響。 3、PDGFR-β siRNA抑制HSC-T6細胞的增殖BrdU摻入試驗表明PDGF-BB明顯促進HSC細胞增殖,而PDGFR-β siRNA能明顯抑制PDGF-B

15、B的促增殖效應(流式細胞法顯示抑制40％的細胞增殖,細胞免疫熒光法顯示抑制35％的細胞增殖)。 4、pCMV-shRNA-LacZ能改善肝纖維化大鼠肝功能,減輕其肝纖維化程度血清肝功能檢測顯示BDL模型大鼠的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(total bilirubin,TB)和間接膽紅

16、素(indirect bilirubin,IDB)水平明顯高于假手術(shù)組和正常組,而pCMV-shRNA-LacZ處理后轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素水平均明顯降低。 5、GFAP基因啟動子能驅(qū)動下游基因在HSC特異表達免疫熒光染色顯示在CCl4介導的急性肝損傷和BDL介導的慢性肝損傷模型中,無論是pCMV-shRNA-LacZ處理組還是pGfa-shRNA-LacZ處理組,大鼠肝臟中β-gal蛋白均主要表達在中央靜脈周圍及匯管區(qū)的細胞中。

17、 6、pGfa-shRNA-LacZ改善BDL大鼠的肝功能,減輕肝纖維化程度血清生化檢測顯示BDL模型組大鼠轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)和膽紅素(TB和IDB)水平明顯升高,而pGfa-shRNA-LacZ處理后升高的轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素水平明顯降低。 結(jié)論 1、用RNAi技術(shù)抑制HSC中PDGFR-β基因表達,阻斷PDGFR-β與PDGF-BB的結(jié)合,可阻斷細胞內(nèi)MAPK信號轉(zhuǎn)導通路進而抑制細胞的增殖,并可顯著抑制HSC的活化