PTPRJ在肝星狀細胞中的表達及肝纖維化發(fā)生中的意義.pdf

1、肝纖維化即肝臟對各種病因所致慢性肝損傷的不完全修復過程，實質(zhì)為肝內(nèi)細胞外基質(zhì)的過量沉積。肝星狀細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，增殖并分泌膠原，是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。體內(nèi)各種促纖維化及抗纖維化因子通過調(diào)節(jié)肝星狀細胞內(nèi)磷酸化活動，精確調(diào)控著細胞上述活性。近年來，受體型蛋白酪氨酸激酶（RPIKs）如血小板源性生長因子受體（PDGFR）、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）、表皮生長因子受體（EGFR）等在肝纖維化發(fā)生過程中的作用受到關注，相應受體

2、蛋白酪氨酸激酶抑制劑作為抗纖維化治療藥物有望得到臨床應用。但是，受體型蛋白酪氨酸磷酸酶（RPIPs），真核細胞內(nèi)控者胞內(nèi)磷酸化及去磷酸化反應過程RPTKs的配對及抗衡分子，所起作用卻少有研究。 PTPRJ（Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type J）是受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，胞內(nèi)為一個催化結(jié)構(gòu)域，胞外為8個纖連蛋白樣重復結(jié)構(gòu)（FNⅢ域），在人類又稱為CD148，密度增強蛋白1（DEP

3、1），蛋白酪氨酸磷酸酶eta（HPTPeta），基因定位于11p11.2。蛋白分子由1337個氨基酸組成，大小約180-230KD；分布于淋巴造血系統(tǒng)、肝臟、胰腺、甲狀腺、腎臟、乳腺、胃腸道上皮、血管內(nèi)膜及神經(jīng)系統(tǒng)及多種腺癌組織。PTPRJ作用底物包括PDGFR、VEGFR、EGFR等多種生長因子受體酪氨酸激酶及下游激酶，使其去磷酸化而失活，從而調(diào)節(jié)細胞間、細胞基質(zhì)間粘附，轉(zhuǎn)導生長抑素受體信號，調(diào)控免疫細胞分化活化、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。P

4、TPRJ基因敲除小鼠胚胎血管發(fā)育不良而夭折，PTPRJ基因座雜合子等位缺失（LOH）常見于人體各系統(tǒng)惡性腫瘤，而在結(jié)腸異常隱窩灶（ACF）中亦常見到?？傊鳛橐环N潛在的抑癌基因，PTPRJ對于細胞去分化、增殖、遷徙等具有負性調(diào)控作用。 已有實驗證實：基底膜類似物Matrigel能夠逆轉(zhuǎn)肝星狀細胞活化，基因干擾、基因敲除、特異性激酶抑制劑等手段抑制PDGF（肝星狀細胞最強的增殖刺激因子）及下游酪氨酸激酶活性，是抑制肝星狀細胞增殖

5、的有效手段。PTPRJ正是介導Matrigel與細胞間作用的信號分子，且PTPRJ可選擇性去磷酸化PDG鄧-R，抑制PDGFR及下游激酶活化，可以推斷：PTPRJ可能介導Mtrigel逆轉(zhuǎn)肝星狀細胞活化，可以通過拮抗PDGF等生長因子受體及下游激酶活化抑制肝星狀細胞增殖，從而對于肝星狀細胞轉(zhuǎn)分化、增殖、遷徙具有重要負性調(diào)節(jié)作用。 但目前尚未證實PTPRJ在肝星狀細胞的表達，尚未研究在肝星狀細胞活化、轉(zhuǎn)分化及纖維化發(fā)生發(fā)展過程中是

6、否存在表達變化。總之，PTPRJ在肝纖維化發(fā)生中的意義尚未得到充分研究。 目的: 以肝纖維化發(fā)生過程中PTPRJ表達情況為研究對象，制備肝纖維化動物模型，觀察大鼠肝纖維化發(fā)生過程中PTPRJ表達量的變化，同時建立Percoll梯度離心法分離培養(yǎng)原代大鼠肝星狀細胞，觀察PTPRJ在原代肝星狀細胞中的表達及在肝星狀細胞活化過程中的表達變化，初步探討PTPRJ在肝纖維化發(fā)生中的意義。 材料和方法: 清潔級雄性S

7、D大鼠36只，隨機分為正常對照組（12只）、造模組（24只），正常對照組皮下注射生理鹽水，造模組接受皮下注射400mg/L CC14/橄欖油溶液6ml/Kg 2次/周，3周、6周、9周結(jié)束時分別處死（末次皮下注射CC14后72h）正常對照組大鼠4只和造模組大鼠8只，取部分肝右葉做HE和Masson染色確定其病理變化，部分肝右葉進行Western-blot檢測其中PTPRJ蛋白表達情況。另取清潔級雄性SD大鼠9只，膠原酶體外灌注、Perc

8、oll密度梯度離心法分離、培養(yǎng)原代肝星狀細胞，對照組為HSC-T6細胞，在培養(yǎng)第3、6、9天分別進行細胞免疫熒光檢測PTPRJ表達情況；同時在培養(yǎng)第3、6、9、12天使用RT-PCR法測定細胞中PTPRJ mRNA表達情況。 所有計量資料以均數(shù)士標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 13.0軟件，計量資料首先分析其正態(tài)及方差齊性。樣本量小，方差不齊，使用非參數(shù)多獨立樣本Kruskal-Wallis H檢驗進行數(shù)據(jù)分析，

9、P≤0.05為分布差異有顯著性統(tǒng)計學意義。 結(jié)果: （1）肝組織病理學變化：HE染色顯示正常對照組肝組織無明顯異常。模型組3wk可見肝細胞氣球樣變性，匯管區(qū)部分炎性細胞浸潤；6wk肝細胞變性壞死明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝界板不清，肝竇及匯管區(qū)內(nèi)大量炎性細胞浸潤，并可見纖維組織增生，9wk多數(shù)肝細胞壞死，大量炎性細胞浸潤，纖維間隔形成明顯、假小葉形成。Masson染色顯示正常對照組少量綠色的膠原纖維分布于匯管區(qū)和中央靜脈管壁

10、，模型組3wk、6wk、9wk可見粗大的綠色的膠原纖維沉積，且隨造模時間的延長而增多，與正常對照組差異有顯著性意義（P<0.05）。 （2）肝纖維化組織PTPRJ表達的變化：肝纖維化組織中隨著造模時間延長，PTPRJ表達減少，模型組3wk、6wk、9wk與對照組比較差異具有顯著性（P<0.05）。 （3）免疫熒光檢測原代肝星狀細胞培養(yǎng)第3天PTPRJ表達為陽性，而陰性對照（HSC-T6細胞）及空白對照組為陰性。培養(yǎng)第6天

11、肝星狀細胞可觀察到ERK、PTPRJ同時表達，而培養(yǎng)第9天活化后的肝星狀細胞可見α-SMA、PTPRJ同時表達。 （4）RT-PCR檢測原代肝星狀細胞PTPRJ mRNA表達為陽性，HSC-T6細胞中PTPRJ mRNA表達為陰性，在肝星狀細胞體外培養(yǎng)自活化過程中，隨著培養(yǎng)時間的延長，PIPRJ mRNA的表達逐步減少，差異有顯著性（P<0.05）。 主要結(jié)論: （1）原代肝星狀細胞中PTPRJ的表達為陽性，而H