FAK在CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化和自發(fā)逆轉(zhuǎn)肝組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與在體肝星狀細(xì)胞增殖的關(guān)系.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝臟對(duì)各種慢性損傷產(chǎn)生的一種修復(fù)反應(yīng)，其主要病理特征是細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝組織內(nèi)的過(guò)度合成和異常沉積。當(dāng)肝臟受到慢性損傷時(shí)，纖維組織生成，損傷因素若不及時(shí)去除，纖維組織則持續(xù)性增生，最終形成肝硬化。肝纖維化是肝硬化發(fā)展的必經(jīng)途徑，肝纖維化是可逆的，而肝硬化則難以逆轉(zhuǎn)。因此，研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，從而阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化至關(guān)重要。
　

2、　 肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)又稱(chēng)Ito細(xì)胞、儲(chǔ)脂細(xì)胞、竇狀隙周?chē)?xì)胞，位于竇周Disse間隙和肝細(xì)胞間窩內(nèi)。正常情況下，HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，而當(dāng)炎癥、損傷等因素刺激時(shí)，HSCs被激活，產(chǎn)生大量以膠原為主的ECM成分和各種細(xì)胞因子。HSCs是肝臟纖維組織生成的主要細(xì)胞，其活化、增殖和遷移可以啟動(dòng)整個(gè)肝纖維化過(guò)程，是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth m

3、uscle actin，α-SMA)是HSCs一個(gè)激活標(biāo)志物，正常肝臟中除了血管壁平滑肌細(xì)胞有少量表達(dá)外，其他肝臟細(xì)胞均無(wú)α-SMA表達(dá)。HSCs活化后難以恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài)，肝臟主要通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制來(lái)去除活化HSCs，而這恰是肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵所在。因此，如何抑制HSCs活化和增殖成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要策略。
　　 黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一種非受體胞質(zhì)酪氨酸激酶，處于整合素和生長(zhǎng)因子等

4、多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)，其缺失或表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái)，對(duì)FAK的研究已從腫瘤領(lǐng)域逐漸延伸至纖維化領(lǐng)域。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)在膽總管結(jié)扎(bileduct ligation，BDL)大鼠肝纖維化模型中，F(xiàn)AK與在體大鼠HSCs活化和增殖呈正相關(guān)。而FAK在肝纖維化逆轉(zhuǎn)中的表達(dá)改變尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的:旨在闡明FAK在肝纖維化發(fā)展以及自發(fā)逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，并探討其動(dòng)態(tài)表達(dá)與HSCs活化、增殖的關(guān)系

5、，從而為尋求有效預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 ①72只健康成年雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為模型組（24只）、逆轉(zhuǎn)組（24只）和對(duì)照組（24只），采用四肢輪流皮下注射40％ CCl4橄欖油溶液（2 ml·kg-1，每周2次）共5周，建立大鼠肝纖維化模型，成功建立動(dòng)物模型后，停止應(yīng)用CCl4并正常飼養(yǎng)5周，建立肝纖維化的自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型，正常大鼠作為對(duì)照組，造模過(guò)程中無(wú)大鼠死亡。

6、>　　 ②Haematoxylinand eosin staining(H&E染色)、Masson's trichrome staining（MT染色）和天狼猩紅染色方法觀察肝臟病理學(xué)改變。
　　 ③免疫熒光方法檢測(cè)大鼠肝組織中FAK及α-SMA的表達(dá)。
　　 ④采用免疫熒光雙標(biāo)記法利用激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定在體活化HSCs中FAK及α-SMA的共表達(dá)改變。
　　 ⑤Westernblot和real-time

7、 fluorescent quantitation PCR(real-time PCR)檢測(cè)FAK蛋白及FAKmRNA在大鼠肝組織中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 ①H&E、MT染色和天狼星紅染色結(jié)果顯示:CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型和自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型成功建立后，隨著CCl4給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，肝細(xì)胞變性壞死逐漸增多，且大鼠肝纖維化程度逐漸加重;在停止注射后，隨著自發(fā)逆轉(zhuǎn)時(shí)間延長(zhǎng)，已形成的纖維組織逐漸減少，肝細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常形態(tài)

8、，再生肝細(xì)胞增多。
　　 ②α-SMA免疫熒光染色顯示:對(duì)照組正常大鼠肝組織中，α-SMA僅在血管壁平滑肌細(xì)胞有弱陽(yáng)性表達(dá)，隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，α-SMA主要分布于纖維間隔、匯管區(qū)及增生的膽管周?chē)?xì)胞，造模1wk、3wk和5wk時(shí)大鼠肝組織內(nèi)α-SMA累積陽(yáng)性光密度值均顯著高于正常對(duì)照組(1.01±0.02 vs0.69±0.02，1.24±0.03 vs0.69±0.02，1.55±0.03 vs0.69±0.02，P＜0.01

9、);且各組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。而在自發(fā)逆轉(zhuǎn)組，隨著自發(fā)逆轉(zhuǎn)時(shí)間的延長(zhǎng)，造模Re1 wk、Re3wk和Re5wk免疫熒光結(jié)果顯示α-SMA陽(yáng)性表達(dá)均顯著低于成功造模5wk組(1.41±0.02 vs1.55±0.03,1.19±0.01 vs1.55±0.03,0.98±0.03 vs1.55±0.03,P＜0.01)，各組之間有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 ③FAK免疫熒光染色顯示:正常大鼠肝組織中FAK蛋

10、白僅在肝竇周?chē)?xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞處，隨肝纖維化進(jìn)展，F(xiàn)AK陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于纖維間隔、匯管區(qū)及增生的膽管周?chē)?xì)胞處。造模1 wk、3wk及5wk大鼠肝組織內(nèi)FAK蛋白的陽(yáng)性光密度值均顯著高于正常對(duì)照組(0.90±0.03 vs0.56±0.03，1.12±0.03 vs0.56±0.03，1.45±0.03 vs0.56±0.03，P＜0.01);各組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。在逆轉(zhuǎn)組，隨著停藥時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)AK蛋白表達(dá)均顯著

11、低于成功造模5 wk組(1.31±0.02 vs1.45±0.03，1.08±0.04 vs1.45±0.03，0.85±0.02 vs1.45±0.03，P＜0.01)，由肝小葉其它部位逐漸減少到肝竇周?chē)?xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞周?chē)?各組之間均有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 ④Western blot分析顯示，造模1 wk、3wk及5 wk大鼠纖維化肝組織中FAK蛋白表達(dá)量均顯著高于正常對(duì)照組(0.42±0.01 vs0.32

12、±0.02，0.51±0.01 vs0.32±0.02，0.64±0.02 vs0.32±0.02，P＜0.01);且各組之間比較也均有顯著性差異（P＜0.05），即大鼠肝纖維化程度越重FAK蛋白表達(dá)越多。在逆轉(zhuǎn)組，造模Re1wk、Re3wk及Re5wk中FAK蛋白表達(dá)量均顯著低于成功造模5wk組(0.58±0.02 vs0.64±0.02,0.49±0.01 vs0.64±0.02,0.40±0.01 vs0.64±0.02,P＜0.

13、01)，呈逐漸降低的趨勢(shì)，且各組之間具有顯著性差異（P＜0.05）;
　　 ⑤實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，造模1 wk、3wk及5wk肝組織中FAK mRNA相對(duì)對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)分別為(4.32±0.08，9.04±0.10，13.12±0.14)，均顯著高于對(duì)照組，P＜0.01;且各組之間隨肝纖維化的加重而逐漸增高（P＜0.05）。而在逆轉(zhuǎn)Re1wk、Re3 wk及Re5 wk中，F(xiàn)AK mRNA的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)分別為(10.5

14、8±0.12，7.74±0.08，3.98±0.04，P＜0.01)，逐漸降低，各組之間均有顯著性差異P＜0.05）;
　　 ⑥FAK和αSMA在HSCs的共表達(dá)產(chǎn)物，主要存在于活化的HSCs細(xì)胞漿中，且共表達(dá)區(qū)域主要集中在纖維間隔、匯管區(qū)及增生的膽管周?chē)?xì)胞，共聚焦激光掃描顯微鏡圖像分析結(jié)果顯示，造模1wk、3wk及5wk大鼠肝組織中FAK表達(dá)陽(yáng)性的活化HSCs占總的活化HSCs的比例分別為(0.63±0.04，0.81±0.

15、03，0.98±0.03)。即隨著肝纖維化的進(jìn)展，活化HSCs中FAK表達(dá)逐漸升高。在逆轉(zhuǎn)Re1wk、Re3 wk及Re5 wk組中，活化HSCs中FAK表達(dá)逐漸減少，并且具有顯著性差異(0.94±0.02，0.77±0.02，0.52±0.03，P＜0.01);
　　 ⑦FAK免疫熒光染色結(jié)果與α-SMA免疫熒光染色結(jié)果、FAK陽(yáng)性的活化HSCs比例進(jìn)行Pearson's相關(guān)性分析，分析結(jié)果顯示，大鼠纖維化肝組織中FAK表達(dá)與