PTEN在纖維化肝組織中的動態(tài)表達及其對肝星狀細胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、肝纖維化（HF）是各種不同致病因子引起慢性肝病進而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經途徑，是肝臟對各種慢性損傷產生的一種修復反應。其主要病理改變是細胞外間質（ECM）的過度合成與異常沉積。肝星狀細胞（HSC）是參與該過程的最重要細胞，它的激活導致自身增殖和膠原合成增加被認為是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，而肝纖維化恢復期HSC凋亡明顯增多。因此，抑制HSC活化、增殖或誘導其凋亡是逆轉肝纖維化的關鍵所在。
　　 第10號染色體缺失的磷酸酶

2、張力蛋白同源物基因（PTEN）是迄今發(fā)現的第一個具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，可負性調控腫瘤細胞細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡，其缺失或表達異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。
　　 近年來，對PTEN的研究已從腫瘤領域逐漸延伸至非腫瘤領域。研究表明，在特發(fā)性肺纖維化患者的肺組織中，成纖維細胞的PTEN表達及其磷酸酶活力都低于正常肺成纖維細胞；并且其過表達或激活可抑制體外肺成纖維細胞增殖、誘導其凋亡。在有關PTEN與

3、心肌纖維化的研究中也顯示PTEN基因敲除的小鼠心臟與體重之比增加、心肌纖維化程度明顯、心肌收縮性降低。這提示PTEN的低表達或失活參與了特發(fā)性肺纖維化及心肌纖維化的發(fā)生。而在PTEN與某些肝臟疾病的研究中，有研究發(fā)現特異性肝細胞PTEN缺失不僅可引起肝細胞癌而且還導致與肝纖維化密切相關的非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生。但迄今為止，PTEN在肝纖維化中的表達及作用，特別是對HSC增殖及凋亡的影響仍不清楚。為此，本研究應用膽總管結扎法建立膽汁淤積

4、性大鼠肝纖維化模型，探討PTEN在肝纖維化過程中的動態(tài)表達及其與在體HSC增殖、凋亡的關系；并進一步將攜帶野生型PTEN基因及其突變體G129E基因的重組腺病毒轉染體外培養(yǎng)的活化HSC，觀察過表達的PTEN對活化HSC增殖、凋亡及細胞周期的影響，同時探討PTEN調控活化HSC增殖、凋亡及細胞周期的信號轉導機制，旨在為深入揭示肝纖維化的病理生理機制，尋求有效預防和治療肝纖維的新策略提供實驗依據。實驗內容主要包括以下四部分：
　　

5、第一部分 PTEN在大鼠纖維化肝組織中的動態(tài)表達及其與在體肝星狀細胞增殖、凋亡的關系
　　 目的：研究大鼠肝纖維化過程中肝組織的PTEN動態(tài)表達及其與在體HSC增殖、凋亡的關系。
　　 方法：膽總管結扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型，HE、Masson三色染色觀察肝臟病理組織學變化，免疫組織化學染色檢測大鼠肝組織中PTEN及α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的分布；免疫熒光雙標記共聚焦激光掃描顯微鏡技術測定大鼠肝組織中活

6、化HSC的PTEN表達；末段脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標記（TUNEL）及α-SMA免疫組織化學雙染檢測在體活化HSC的凋亡；Western blot和Real-time Q-PCR檢測大鼠肝組織中PTEN蛋白及mRNA表達。
　　 結論：膽總管結扎法成功建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型；大鼠肝纖維化形成過程中HSC的活化、增殖逐漸加快，而活化HSC的凋亡指數卻逐漸減少；隨著肝纖維化進展，大鼠肝組織中PTEN蛋白

7、及mRNA表達逐漸下調，在體HSC的PTEN表達亦降低，其動態(tài)表達與在體HSC的活化、增殖呈顯著負相關，而與活化HSC凋亡指數呈顯著正相關。
　　 第二部分 PTEN對體外活化肝星狀細胞增殖與凋亡的影響
　　 目的：探討過表達的野生型PTEN及其突變體G129E（喪失了脂質磷酸酶活性僅保留蛋白磷酸酶活性）對體外活化的HSC增殖、凋亡的影響及可能的機制。
　　 方法：利用AD293細胞擴增實驗所需的腺病毒（Ad-P

8、TEN、Ad-G129E、Ad-GFP），并測定滴度；以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時轉染體外培養(yǎng)的活化的HSC； Western blot及Real-time Q-PCR檢測HSC PTEN表達；MTT法檢測HSC增殖；TUNEL及碘化丙啶（PI）標記的流式細胞術測定HSC凋亡；Western blot檢測HSC的凋亡調控基因Bcl-2及Bax表達。實驗分組如下：①Control組，僅以含8％胎牛血清的D

9、MEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，在轉染步驟入無血清無抗生素DMEM代替病毒液；②Ad-GFP組，轉染表達綠色熒光蛋白（GFP）的空病毒Ad-GFP；③Ad-PTEN組，轉染攜帶野生型PTEN基因并表達GFP的重組腺病毒Ad-PTEN；④Ad-G129E組，轉染攜帶PTEN的突變體G129E基因并表達GFP的重組腺病毒Ad-G129E。
　　 結論：外源性野生型PTEN基因及G129E基因成功轉染體外活化HSC；其過表達可明顯抑制活化H

10、SC增殖，誘導活化HSC凋亡，并引起HSC的凋亡調控基因Bax表達增加，Bcl-2表達下降。而且野生型PTEN的作用明顯強于G129E。
　　 第三部分 PTEN對體外活化肝星狀細胞細胞周期的調控作用
　　 目的：探討過表達的野生型PTEN及其突變體G129E對體外活化HSC細胞周期的調控作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)活化的HSC，以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時轉染體外活化的HSC；

11、流式細胞術測定HSC細胞周期時相；Western blot及Real-time Q-PCR檢測HSC的PTEN、細胞周期素D1（CyclinD1）、細胞周期素依賴性激酶4（CDK4）及細胞周期素依賴性激酶抑制因子（CDI）之一的P27kip1蛋白及mRNA表達。實驗分組同第二部分。
　　 結論：過表達的野生型PTEN及G129E顯著抑制體外活化HSC細胞周期G1/S期轉化，阻滯HSC細胞周期時相于G0/G1期；同時在轉錄和翻譯水

12、平上下調活化HSC的cyclinD1、CDK4表達，上調P27kip1表達，這可能是其阻滯活化HSC細胞周期進程的重要機制。并且，在上述作用中野生型PTEN明顯強于G129E。
　　 第四部分 PTEN調控活化肝星狀細胞行為的信號轉導機制
　　 目的：探討PTEN調控活化肝星狀細胞增殖、凋亡及細胞周期的信號轉導機制。
　　 方法：體外培養(yǎng)活化HSC，以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時轉

13、染體外活化HSC； Western blot檢測HSC的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B（Akt）、p-Akt（Thr308）、細胞外信號調節(jié)激1（ERK1）、p-ERK1蛋白表達；Real-time Q-PCR檢測Akt、ERK1 mRNA表達。實驗分組同第二部分。
　　 結論：PTEN通過其磷酸酶活性抑制Akt及ERK1的磷酸化；其負性調控活化HSC細胞周期、抑制活化HSC增殖及誘導活化HSC凋亡的作用與PI3K/Akt、ERk1/