RNA干擾抑制肝星狀細(xì)胞CTGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：慢性肝病(主要是慢性病毒性肝炎)是我國(guó)常見(jiàn)病之一，其重要病理基礎(chǔ)是肝纖維化，肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同病理基礎(chǔ)，如能阻斷、減輕乃至逆轉(zhuǎn)肝纖維化，就能在很大程度上改善肝病的預(yù)后，因而這就成為肝病治療學(xué)的一個(gè)重大課題。肝纖維化顯著特征是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成和降解失衡最終引起ECM過(guò)渡沉積所致，肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化時(shí)ECM過(guò)多產(chǎn)生和異常沉積的主要細(xì)胞來(lái)源，在肝纖維化形成過(guò)程中，HSC受細(xì)胞因子、基質(zhì)

2、成分改變和氧化物應(yīng)激而激活，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)始終是人們的研究熱點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 1(TGF-β<,1>)是目前已知最強(qiáng)的促肝纖維化的細(xì)胞因子，而且是肝纖維化形成過(guò)程中重要的始動(dòng)刺激因子之一。用反義寡核苷酸或核心蛋白酶抑制TGF-β 1的過(guò)度表達(dá)，可改善實(shí)驗(yàn)性肝纖維化動(dòng)物模型的纖維化程度。但是由于TGF-β 1作用的靶細(xì)胞種類繁多、生物學(xué)效應(yīng)復(fù)雜，TGF-β 1的受體存在于大多數(shù)細(xì)胞中，因此完全阻斷其表達(dá)或抑制其活性后果難以預(yù)料。有研究

3、表明，敲除TGF-β 1基因的小鼠因失去對(duì)炎癥的抑制，出生后很快死于嚴(yán)重的全身性炎癥反應(yīng)。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種在器官纖維化病變中起中心作用的細(xì)胞因子，CTGF有可能是TGF-β 1致纖維化作用的直接下游效應(yīng)介質(zhì)；在創(chuàng)傷修復(fù)或纖維化過(guò)程中，CTGF是一種特異性更強(qiáng)的、可選擇性地干預(yù)結(jié)締組織形成的細(xì)胞因子，阻斷其表達(dá)可能是較特異、較有效的治療纖維化的方法，目前CTGF已成為可能替代TGF-β l治療纖維化疾病的靶細(xì)

4、胞因子。RNA干擾是目前最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。本研究應(yīng)用免疫組化研究慢性乙型肝炎病人肝組織中CTGF的表達(dá)，探討CTGF與TGF-β1及肝纖維化的關(guān)系；構(gòu)建3條針對(duì)CTGF的短發(fā)夾RNA(shRNA)，通過(guò)轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞后篩選出有效抑制CTGF表達(dá)的序列；并以CrGF為靶基因進(jìn)行RNA干擾，研究其對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF-β1、CTGF基因及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋

5、白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CIV)等細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討CTGF在肝纖維化的作用及肝纖維化基因治療的可行陛。 結(jié)論： 1慢性乙型肝炎肝組織高度表達(dá)CTGF，與TGF-β1在肝內(nèi)表達(dá)的增強(qiáng)程度呈正相關(guān)，并與病理上肝纖維化程度平行，與血清中細(xì)胞外基質(zhì)水平呈正相關(guān)，提示CTGF與TGF-β1在肝纖維化時(shí)可能是相伴表達(dá)，作用上具有協(xié)同性；CTGF、TGF-β1對(duì)肝纖維化的形成與發(fā)展具有促進(jìn)作用；

6、 2利用含U6啟動(dòng)子及增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)的質(zhì)粒載體pEGFP可成功構(gòu)建CTGF的shRNA干擾重組體，將構(gòu)建成功的3組pEGFP—CTGFshRNA轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞后，其中兩組能高效抑制CTGF的表達(dá)：3 CTGF可能為T(mén)GF－β1發(fā)揮纖維化作用的下游介質(zhì)； 4 pEGFP—CTGFshRNA能高效抑制肝星狀細(xì)胞中CTGF及細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)；CTGFshRNA介導(dǎo)的RNA干擾有望對(duì)慢性肝病所致肝纖維化具有治療潛力。