短發(fā)卡RNA干擾技術(shù)阻斷PTEN表達對體外活化肝星狀細胞膠原代謝的影響.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是各種致病因素引起肝損傷的一種修復反應(yīng),是慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的必經(jīng)途徑。其主要特征是以膠原為主的細胞外間質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成增多,降解減少,從而引起細胞間質(zhì)過度沉積。肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝臟合成ECM的主要來源細胞,HSC經(jīng)過活化、增殖、黏附、遷移等過程,表達各種信號轉(zhuǎn)導蛋白,合成大量以Ⅰ、Ⅲ型膠

2、原為主的ECM成分和細胞因子,是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。
　　 第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase andtensin homology deleted on chromosome Ten,PTEN)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有特異性雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因。它不僅可以通過信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控細胞的周期,抑制細胞的增殖,誘導其凋亡,還參與調(diào)節(jié)細胞的遷移、黏附。近年來,對PTEN的研究已經(jīng)從腫瘤領(lǐng)域

3、延伸到非腫瘤領(lǐng)域,成為新近研究的熱點。有研究發(fā)現(xiàn),PTEN基因與纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),而我們的前期研究亦表明,在膽總管結(jié)扎肝纖維化大鼠肝組織中PTEN蛋白及mRNA表達均低于正常大鼠肝組織,并與在體HSC的活化、增殖呈顯著負相關(guān);過表達的PTEN可顯著抑制體外活化HSC的增殖、誘導其凋亡,負性調(diào)控活化HSC的細胞周期進程;而低表達的PTEN可正性調(diào)控活化HSC的細胞周期進程,并引起磷酸化Akt和ERK蛋白的表達增多。
　　

4、RNA干擾(RNA interference,RNAi)是目前應(yīng)用的最有效的基因沉默技術(shù),能高效特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄,進而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。為此,我們在前期研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了靶向PTEN的短發(fā)卡RNA(shorthairpin RNA,shRNA)干擾重組體,并在體外感染活化的大鼠肝星狀細胞系HSC-T6,觀察阻斷PTEN表達對體外活化HSC膠原代謝的影響,從反面探討PTEN對HSC膠原代謝的影響及其機制,從而為尋求抗肝纖維化

5、的基因治療提供理論依據(jù)。
　　 目的:采用RNAi技術(shù),以腺病毒為載體,構(gòu)建靶向PTEN的短發(fā)卡RNA干擾重組體(PTEN shRNA),觀察阻斷PTEN表達對體外活化HSCⅠ、Ⅲ型膠原表達的影響,以及該過程中MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2的表達變化。
　　 方法:利用AD293T細胞擴增實驗所需的腺病毒(Ad-EGFP、PTENshRNA),并在體外感染活化的大鼠肝星狀細胞系HSC-T6。實驗分組

6、如下:①Control組,僅以含10％胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,在轉(zhuǎn)染步驟加入無血清無抗生素DMEM代替病毒液;②Ad-EGFP組,轉(zhuǎn)染表達增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的空病毒Ad-EGFP;③PTEN shRNA組,轉(zhuǎn)染靶向PTEN的短發(fā)卡RNA干擾重組體并表達EGFP的重組腺病毒PTEN shRNA。
　　 采用熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染

7、效率;采用Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后PTEN蛋白的表達;采用免疫細胞化學方法觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達情況;采用Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 ①通過反復感染AD293T細胞的方法使病毒擴增,獲得了實驗所需的病毒液(Ad-EGFP、PTEN shRNA的滴度分別為1.2×109 pfu/mL、1.1

8、×109 pfu/mL)。
　　 ②應(yīng)用Western blot技術(shù)分析顯示,在腺病毒感染后72 h,PTEN shRNA組的PTEN蛋白表達(1.10±0.03)顯著低于Control組(1.47±0.07)及Ad-EGFP組(1.38±0.08),P＜0.01;而Control組與Ad-EGFP組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 ③免疫細胞化學染色顯示,在感染后72h,Ⅰ、Ⅲ型膠原在PTEN shRNA組HS

9、C中的表達明顯高于在Control組與Ad-EGFP組HSC中的表達;
　　 ④應(yīng)用Western blot技術(shù)分析證實,在腺病毒感染后72h,PTEN shRNA組Ⅰ型膠原蛋白表達(0.41±0.01)顯著高于Control組(0.32±0.01)及Ad-EGFP組(0.33±0.01),P＜0.01;而Control組與Ad-EGFP組之間無顯著性差異(P＞0.05);PTEN shRNA組Ⅲ型膠原蛋白表達(0.38±0.0

10、3)高于Control組(0.29±0.03)及Ad-EGFP組(0.29±0.04),P＜0.05;Control組與Ad-EGFP組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 ⑤應(yīng)用Western blot技術(shù)分析顯示,在腺病毒感染后72h,PTEN shRNA組MMP-13蛋白表達(0.41±0.02)顯著低于Control組(0.66±0.04)及Ad-EGFP組(0.71±0.05),P＜0.01;Control組與Ad

11、-EGFP組之間無顯著性差異(P＞0.05);PTEN shRNA組的TIMP-1蛋白表達(0.27±0.001)顯著高于Control組(0.23±0.01)及Ad-EGFP組(0.22±0.01),P＜0.01;Control組與Ad-EGFP組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 ⑥應(yīng)用Western blot技術(shù)分析顯示,在腺病毒感染后72h,PTEN shRNA組MMP-2蛋白表達(0.29±0.01)顯著低于Co

12、ntrol組(0.34±0.01)及Ad-EGFP組(0.33±0.003),P＜0.01;Control組與Ad-EGFP組之間無顯著性差異(P＞0.05):PTEN shRNA組TIMP-2蛋白表達(1.26±0.03)高于Control組(0.96±0.01)及Ad-EGFP組(0.93±0.01),P＜0.05:Control組與Ad-EGFP組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:重組腺病毒PTEN shRN