自噬抑制劑氯喹對(duì)體外活化肝星狀細(xì)胞膠原代謝的影響.pdf

1、肝纖維化(Hepaticfibrosis，HE)是各種不同致病因素引起慢性肝病進(jìn)而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑，是肝臟對(duì)各種慢性損傷產(chǎn)生的一種修復(fù)反應(yīng)。其主要病理特征是以膠原為主的細(xì)胞外間質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)在肝組織內(nèi)的過度合成和異常沉積。肝纖維化是可逆的，而肝硬化則難以逆轉(zhuǎn)。因此，阻止甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療各種慢性肝病、預(yù)防其向肝硬化發(fā)展的關(guān)鍵所在。對(duì)于肝纖維化的防治，迄今尚乏真正有效治療手段，

2、深入研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制進(jìn)而探索有效防治措施，對(duì)于治療各種慢性肝病，預(yù)防其向肝纖維化、肝硬化發(fā)展有著重要意義。
　　 肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells，HSCs)是肝纖維化發(fā)生過程中產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞，HSCs活化是肝纖維化形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，在肝纖維化發(fā)展過程中扮演重要角色。靜止?fàn)顟B(tài)下，HSCs胞漿內(nèi)富含脂滴，已有研究表明脂滴的存在能抑制HSCs的活化，而HSCs活化的最具特征性表現(xiàn)是胞漿內(nèi)脂滴的丟失，轉(zhuǎn)

3、化為肌成纖維細(xì)胞，并主要通過兩種作用機(jī)制促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程:以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的ECM成分生成過多，降解不足;合成并釋放一些重要的促進(jìn)纖維化發(fā)生、慢性炎癥和血管生成的細(xì)胞因子。近來，F(xiàn)riedman等研究發(fā)現(xiàn)，在HSCs活化過程中，胞漿內(nèi)脂滴的丟失與自噬(autophagy)相關(guān)，自噬可通過降解脂滴為HSCs活化提供能量。相反，抑制自噬可減少HSCs活化并降低其纖維生成能力，主要表現(xiàn)為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleact

4、in，α-SMA)、Ⅰ型膠原等表達(dá)下降。
　　 自噬是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體(autophagosome)，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，進(jìn)一步降解其所包裹的多余的蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞成分，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要和某些細(xì)胞器的更新，維持自身的穩(wěn)定。自噬的整個(gè)過程主要分為3個(gè)階段:自噬體的初步形成;自噬體膜的延伸;自噬體與溶酶體融合并降

5、解。氯喹(Chloroquine，CQ)可通過升高溶酶體內(nèi)PH值，阻止自噬體與溶酶體的結(jié)合而抑制自噬。
　　 目前國內(nèi)外對(duì)自噬在肝纖維化中的研究主要側(cè)重于其對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的影響，而自噬對(duì)活化后的HSCs的生物學(xué)作用尚缺乏研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以此為出發(fā)點(diǎn)，研究應(yīng)用不同濃度的自噬抑制劑CQ干預(yù)活化的HSC-T6細(xì)胞后，Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制

6、因子(tissueinhibitionofmatrixmetalloproteinase，TIMPs)的表達(dá)變化，旨在完善自噬對(duì)HSCs膠原代謝的影響。
　　 目的:研究不同濃度的自噬抑制劑CQ對(duì)活化HSC-T6的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響以及該過程中MMP-2、TIMP-2、MMP-13和TIMP-1的表達(dá)變化。
　　 方法:應(yīng)用TGF-β1刺激大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6，使其處于完全活化狀態(tài)，給予不同濃度的CQ干預(yù)24

7、h。實(shí)驗(yàn)分組如下:①Control組，僅以含10％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，在TGF-β1刺激步驟加入等體積TGF-β1的溶劑枸櫞酸鈉溶液;②TGF-β1組，以含10％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，待70％融合后加入終濃度為20ng/ml的TGF-β1;③TGF-β1+CQ15μmol/L組，在給予TGF-β1刺激的同時(shí)加入濃度為15μmol/L的CQ干預(yù);④TGF-β1+CQ30μmol/L組，在給予TGF-β1刺

8、激的同時(shí)加入濃度為30μmol/L的CQ干預(yù);⑤TGF-β1+CQ60μmol/L組，在給予TGF-β1刺激的同時(shí)加入濃度為60μmol/L的CQ干預(yù)。
　　 采用MTT法檢測細(xì)胞活力;Westernblot技術(shù)檢測自噬標(biāo)識(shí)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和P62蛋白的表達(dá)情況;免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原的定位表達(dá)量;Westernblot技術(shù)檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2、TIMP-2、MMP-13和TIMP-1蛋白的表達(dá);R

9、eal-timeQ-PCR檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2、TIMP-2、MMP-13和TIMP-1基因水平的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:①用含10％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，待70％融合后加入TGF-β1，濃度分別為5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml，干預(yù)24h后，采用MTT法檢測細(xì)胞活力并繪制曲線，起始隨著TGF-β1濃度的升高細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，在濃度達(dá)到2

10、0ng/ml后，繼續(xù)升高濃度細(xì)胞活力增加不明顯。因此，選擇20ng/ml作為本實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度。②應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和P62蛋白在上述5組細(xì)胞中的表達(dá)，其結(jié)果顯示:LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相對(duì)表達(dá)量依次為0.63±0.08、0.61±0.12、1±0.1、1.5±0.3、2.4±0.17，TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組(P＜0.01)，TGF-β1+CQ組之間也有顯著性差異(P＜0.01

11、);P62蛋白的相對(duì)表達(dá)量依次為4.4±0.4、4.1±0.33、5.9±0.25、6.2±0.31、6.1±0.43，TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組（P＜0.01），而TGF-β1+CQ組之間無顯著性差異（P＞0.05）。③MTT法檢測細(xì)胞活力顯示:以Control組的細(xì)胞活力定義為100％，其余4組分別為115％、89％、48％、27％，TGF-β1組較Control組顯著升高，TGF-β1+CQ組較Control組和

12、TGF-β1組均顯著下降（P＜0.01），TGF-β1+CQ組中隨CQ劑量增加，細(xì)胞活力下降具有顯著性差異(P＜0.01)。④Westernblot技術(shù)檢測α-SMA表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量依次為0.84±0.12、1.23±0.21、1.18±0.16、1.2±0.23、1.31±0.33，TGF-β1組和TGF-β1+CQ組均顯著高于Control組(P＜0.05)，而TGF-β1組和TGF-β1+CQ各組之間無顯著性差異（P＞0.05）

13、。⑤免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示:TGF-β1組的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)量較Control組顯著增加，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組也有明顯增加。⑥應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原在上述5組細(xì)胞中的表達(dá)，其結(jié)果顯示:Ⅰ型膠原的相對(duì)表達(dá)量依次為0.81±0.13、1.12±0.11、1.43±0.17、1.6±0.14、1.95±0.2，TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組(P＜0.01)，TGF-β1+CQ30μmol/L

14、組顯著高于TGF-β1+CQ15μmol/L組(P＜0.01)，TGF-β1+CQ60μmol/L組顯著高于TGF-β1+CQ30μmol/L組(P＜0.05);Ⅲ型膠原的相對(duì)表達(dá)量依次為0.84±0.15、1.28±0.2、1.84±0.13、3.1±0.23、3.9±0.32,TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組(P＜0.01)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異（P＜0.01）。⑦應(yīng)用Real-timeQ-PCR方法

15、檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)，其結(jié)果顯示:以Control組的mRNA表達(dá)量為1，Ⅰ型膠原其余4組的相對(duì)表達(dá)量依次為1.8±0.06、2.1±0.11、2.5±0.08、2.8±0.13，TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組(P＜0.05)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異（P＜0.05）;Ⅲ型膠原的相對(duì)表達(dá)量依次為2.1±0.13、2.7±0.07、3±0.17、3.7±0.09，TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF

16、-β1組（P＜0.05），TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異（P＜0.05）。⑧應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測MMP-2和TIMP-2蛋白的表達(dá)，其結(jié)果顯示:MMP-2蛋白各組的表達(dá)量依次為1.01±0.11、0.67±0.08、0.69±0.06、0.71±0.1、0.74±0.09，TGF-β1組和TGF-β1+CQ組較Control組明顯下降(P＜0.05)，但TGF-β1組和TGF-β1+CQ各組之間沒有顯著性差異;T

17、IMP-2的相對(duì)表達(dá)量依次為0.87±0.08、1.19±0.13、1.31±0.11、1.58±0.17、1.82±0.16，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著增加（P＜0.05），TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異(P＜0.05)。⑨應(yīng)用Real-timeQ-PCR方法檢測MMP-2和TIMP-2的mRNA表達(dá)，其結(jié)果顯示:以Control組的mRNA表達(dá)量為1，MMP-2其余4組的相對(duì)表達(dá)量依次為2.61±0.11、2

18、.8±0.1、3.2±0.14、3.8±0.17，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著增加(P＜0.05)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異（P＜0.05）;TIMP-2其余4組的相對(duì)表達(dá)量依次為1.5±0.03、2.8±0.06、3.6±0.06、4.2±0.02，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著增加(P＜0.05)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異（P＜0.01）。⑩應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測MM

19、P-13和TIMP-1蛋白的表達(dá)，其結(jié)果顯示:MMP-13蛋白各組的表達(dá)量依次為:1.64±0.03、1.27±0.07、0.84±0.1、0.55±0.07、0.46±0.09,TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著下降（P＜0.05），TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異(P＜0.05);TIMP-1蛋白各組的表達(dá)量依次為:0.84±0.11、1.02±0.09、1.25±0.04、1.48±0.12、1.6±0.05，TGF

20、-β1+CQ組顯著高于TGF-β1組（P＜0.01），TGF-β1+CQ各組之間具有顯著性差異(P＜0.01)。(⑾)應(yīng)用Real-timeQ-PCR方法檢測MMP-13和TIMP-1的mRNA表達(dá)，其結(jié)果顯示:以Control組的mRNA表達(dá)量為1，MMP-13其余4組的相對(duì)表達(dá)量依次為3.1±0.12、2.2±0.06、1.8±0.03、1.2±0.03，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著下降(P＜0.05)，TGF-β1+C