人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來源的exosomes對肝星狀細(xì)胞活化的抑制研究.pdf

1、目的:肝星狀細(xì)胞(HSC)在肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，而前期研究已證實(shí)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(hucMSC)來源的囊泡(exosomes)對四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠肝臟纖維化具有修復(fù)效果，在此基礎(chǔ)上本課題著重探討hucMSC來源的exosomes(hucMSC-ex)對HSC活化的抑制作用及其可能機(jī)制。為hucMSC-ex臨床治療肝臟纖維化提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。
　　方法:體外研究采用重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)

2、誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞系LX2活化，再分別加入hucMSC-ex、RNase-ex（經(jīng)RNA酶處理后的hucMSC-ex）及HFL1-ex(人肺成纖維細(xì)胞來源的exosomes)作用48 h，觀察exosomes作用前后LX2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，通過RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測作用前后LX2活化相關(guān)指標(biāo)，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、成纖維細(xì)胞激活蛋白α(FAP-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、組織金屬蛋白酶抑制劑1(

3、TIMP1)及TGF-β1/Smad信號(hào)通路的相關(guān)基因或蛋白表達(dá)變化。體內(nèi)研究構(gòu)建CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟纖維化模型，損傷6周后肝臟定點(diǎn)注射hucMSC-ex，RNase-ex及HFL1-ex，以注射PBS為對照組。3周后收集各組小鼠血清和肝臟組織，通過連續(xù)監(jiān)測法檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量;組織免疫組化、免疫熒光、病理HE染色、Masson's三色染色、RT-PCR及Western blot等技術(shù)檢測肝組織

4、中的炎癥浸潤情況，HSC活化相關(guān)蛋白α-SMA、FAP-α及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)，以及肝纖維化相關(guān)TGF-β1、磷酸化smad2(p-smad2)、纖維連接蛋白(Fibronectin)及膠原纖維的表達(dá)變化，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)綜合評價(jià)hucMSC-ex通過對HSC活化的抑制而達(dá)到修復(fù)肝纖維化的效果及可能機(jī)制。
　　結(jié)果體外研究顯示，重組人TGF-β1誘導(dǎo)后，LX2細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則星狀形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形，兩極拉長似成纖維細(xì)胞;同時(shí)

5、RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示誘導(dǎo)后LX2細(xì)胞中的α-SMA、FAP-α、MMP2及TIMP1表達(dá)明顯上調(diào)。加入hucMSC-ex作用后，LX2細(xì)胞的紡錘樣形態(tài)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，α-SMA、FAP-α、MMP2及TIMP1的表達(dá)下降。而RNase-ex及HFL1-ex組的LX2細(xì)胞形態(tài)上大部分同TGF-β1組類似，呈成纖維細(xì)胞樣;且仍高表達(dá)α-SMA及FAP-α。同樣MTT實(shí)驗(yàn)提示hucMSC-ex能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX

6、2增殖，但RNase-ex組及HFL1-ex組的LX2細(xì)胞增殖能力與TGF-β1組無明顯差異。進(jìn)一步的Western blot結(jié)果顯示hucMSC-ex降低了LX2細(xì)胞Smad2/3蛋白的磷酸化水平。體內(nèi)研究在成功建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模犁的基礎(chǔ)上，血清學(xué)和肝組織病理學(xué)分析顯示hucMSC-ex減弱了HSC的活化，改善了CCl4誘導(dǎo)的肝臟纖維化損傷。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBS組小鼠與常規(guī)飼養(yǎng)組小鼠相比，肝組織中α-SMA及FAP-α

7、陽性細(xì)胞百分比明顯增多;而hucMSC-ex組小鼠肝組織中α-SMA及FAP-α陽性細(xì)胞百分比顯著減少，RNase-ex及HFL1-ex組與PBS組無明顯差異;同樣，免疫熒光結(jié)果顯示小鼠肝組織中α-SMA及PCNA的表達(dá)在PBS組顯著增強(qiáng)，而在hucMSC-ex組明顯減弱，RNase-ex組及HFL1-ex組與PBS組基本一致;RT-PCR和Western blot結(jié)果也顯示hucMSC-ex組同PBS組、RNase-ex組及HFL1-

8、ex組相比顯著降低了α-SMA及FAP-α的mRNA及蛋白的表達(dá)（均P＜0.05）。同時(shí)觀察到肝纖維化相關(guān)指標(biāo)TGF-β1、p-smad2、Fibronectin及膠原纖維在hucMSC-ex組的表達(dá)，較PBS組、RNase-ex組及HFL1-ex組相比顯著降低。
　　結(jié)論 HucMSC-ex體外經(jīng)降低TGF-β1/Smads通路的活化而逆轉(zhuǎn)了TGF-β1誘導(dǎo)的LX2向成纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，體內(nèi)抑制了肝星狀細(xì)胞的活化從而修復(fù)CCl4