小鼠臍帶間質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的:建立小鼠臍帶來源的間質(zhì)干細胞(mouse umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells，mUC-MSCs)的分離培養(yǎng)方法，分析其生物學(xué)特性，并比較其與小鼠骨髓來源的間質(zhì)干細胞(mousebone marrow-derived mesenchymal stem cells, mBM-MSCs)的差異，初步探討Toll樣受體3(TLR3)對mUC-MSCs特性的影響。
　　方法:采用改

2、良組織塊貼壁法分離培養(yǎng)mUC-MSCs，在含有15％胎牛血清的F12/DMEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)、純化及傳代擴增。采用全骨髓貼壁法分離獲得mBM-MSCs。通過細胞形態(tài)觀察、生長曲線繪制、流式細胞術(shù)檢測及成脂/成骨誘導(dǎo)實驗，分別對mUC-MSCs和mBM-MSCs進行形態(tài)學(xué)、生長特性、細胞周期、免疫表型(CD29、CD34、CD45、CD44和CD11b)和多向分化潛能的比較分析;采用Western blot檢測長期培養(yǎng)中mUC-MSCs

3、干性相關(guān)蛋白(Oct4、Sox2、Sall4和Nanog)表達水平的改變，并比較mUC-MSCs和mBM-MSCs中干性相關(guān)蛋白（Oct4、Sox2、Sall4、Nanog和β-catenin）表達的差異;qRT-PCR分析兩者間9種炎癥相關(guān)因子、成脂分化相關(guān)分子Adiponectin和成骨分化相關(guān)分子Runx2的基因表達差異。以Poly(I∶C)作為TLR3的激動劑，綜合運用Western blot、細胞平板克隆實驗、液相芯片(Lum

4、inex)分析和qRT-PCR評價Poly(I∶C)預(yù)處理對mUC-MSCs的干性蛋白表達、克隆增殖能力、細胞因子分泌及其基因水平表達的影響。
　　結(jié)果:mUC-MSCs原代培養(yǎng)6-12天進行首次傳代，傳至第5至第7代時純化，形態(tài)均一，呈長梭形，至20代時細胞形態(tài)無明顯改變。mUC-MSCs在長達60次的傳代培養(yǎng)中，其4種干性相關(guān)蛋白（Oct4、Sox2、Sall4和Nanog）的表達呈一致性的先升高后降低的趨勢，30代以內(nèi)細胞的

5、細胞周期無明顯改變，依然維持較高的增殖潛能。mUC-MSCs與mBM-MSCs形態(tài)相似，而前者更易純化;生長曲線和細胞周期的檢測顯示mUC-MSCs的增殖能力低于mBM-MSCs;流式分析表明，兩者均表達干細胞標(biāo)記CD29和CD44，不表達造血標(biāo)記CD34、CD45和單核/巨噬細胞標(biāo)記CD11b;兩者均具有成脂和成骨分化潛能，且mUC-MSCs的分化效率明顯低于mBM-MSCs;mUC-MSCs中Oct4、Sox2、Nanog和Sall

6、4的蛋白表達顯著強于mBM-MSCs，與β-catenin的表達相反;mBM-MSCs中IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS和CCL5的基因表達都明顯高于mUC-MSCs。mUC-MSCs經(jīng)Poly(I∶C)預(yù)處理后，其干性蛋白表達和克隆增殖能力均增強，IL-6、IL-8、CCL5和CXCL10的基因表達顯著增強，且IL-6、CXCL10和MCP-1的分泌增加。
　　結(jié)論:成功建立了mUC-MSCs的分離培養(yǎng)方法