骨髓間質干細胞體內突變致瘤及其腫瘤干細胞分離與生物學特性研究.pdf

1、目的：研究大鼠間質干細胞體內致瘤模型及致瘤后獲得單克隆腫瘤細胞株(K3)的生物學特性；建立K3腫瘤干細胞(K3-SP)分離、鑒定的方法；初步采用細胞生物學與分子生物學技術等探討K3腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞的生物學特性及基因表達；探討無血清培養(yǎng)對K3腫瘤干細胞的富集作用。
　　 方法：采用生長曲線、流式表面標記、PCR、免疫組化等技術來研究K3細胞的生物學特性。制備K3細胞懸液，經過Hoechst33342熒光染料染色，流式細胞儀

2、分析并分選出SP亞群。采用五種培養(yǎng)方法培養(yǎng)K3：5％FBS、10％FBS、無血清、無血清加三種生長因子培養(yǎng)K3及K3細胞BALB/c裸鼠皮下致瘤。獲得足夠量的K3細胞后，取瘤組織過400目銅網得到單細胞懸液。單細胞懸液經過Hoechst33342熒光染料染色，使用流式細胞儀分選出K3-SP細胞和K3-NSP-細胞。分選得到的K3-SP細胞和K3-NSP細胞進行BALB/c裸鼠皮下致瘤實驗并觀察比較瘤體積的大小。使用晶芯(R)大鼠全基因組

3、寡核苷酸微陣列芯片比較K3-SP/K3-NSP細胞基因表達差異，使用熒光實時定量RT-PCR驗證差異表達基因。比較K3-SP致瘤組織和K3-SP致瘤組織ABCG2、OCT4、PCNA、P53的免疫組化結果。利用無血清培養(yǎng)以富集K3-SP細胞。
　　 結果：K3腫瘤細胞表達大鼠間質干細胞相似的表面抗原如CD29,CD44,CD90,弱表達CD45；K3腫瘤細胞具有一般腫瘤細胞表達基因與生長特性，能夠在BALB/c裸鼠致瘤；K3腫瘤

4、細胞具有異質性，同時含有少量的腫瘤干細胞。不同胎牛血清濃度培養(yǎng)下，K3細胞中K3-SP細胞含量有差異，5％FBS培養(yǎng)與10％FBS培養(yǎng)分析得K3-SP含量分別為1.01％和0.73％。K3-SP較K3-NSP BLAB/c裸鼠致瘤率明顯增強，5×103K3-SP細胞即可裸鼠致瘤，其組織類型為纖維肉瘤?；蛐酒治鲲@示，K3-SP與K3-NSP差異表達基因56個，其中上調40個，下調16個，Real-timePCR驗證了T-Bx3、Maf

5、b、Plk2等上調基因和Vegf一個下調基因。免疫組化顯示K3-SP致瘤組織為P53、Pcna、Abcg2、Oct4陽性，而K3-NSP致瘤組織為陰性。K3細胞在含有bFGF、EGF、LIF三種因子的無血清培養(yǎng)基與不含三種因子的培養(yǎng)基中均呈懸浮球狀生長，Real-time PCR顯示Oct4在兩種無血清培養(yǎng)基中表達均有差異。無血清加三種因子培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天后，SP含量達到7.73％，具有明顯的富集K3-SP的作用。
　　 結論