臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性、向神經(jīng)樣細(xì)胞的分化及細(xì)胞移植治療顱腦損傷的研究.pdf

1、第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化及基本生物學(xué)特性研究 目的：探討從人臍帶組織分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的方法，并對(duì)獲取的MSC進(jìn)行擴(kuò)增、純化，研究其基本生物學(xué)特性。 方法：無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，以20ml注射器分別插入兩根臍靜脈及一跟臍動(dòng)脈內(nèi)，反復(fù)沖洗，沖去血管內(nèi)的殘存積血。組織剪將臍帶剪碎，直至1mm3大小組織塊。直接將組織塊接種于含DMEM/F12培養(yǎng)基或?qū)⒔M織塊經(jīng)酶消化法獲取單個(gè)核細(xì)胞后接種于DM

2、EM/F12培養(yǎng)基。進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察并記錄其形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)時(shí)，消化傳代進(jìn)行純化和擴(kuò)增培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSC的細(xì)胞表面標(biāo)志。繪制細(xì)胞生長曲線，通過5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其增殖能力。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。RT-PCR檢測(cè)OCT-4mRNA表達(dá)。透射電鏡觀察臍帶MSC的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：兩種分離方法均可獲得成纖維樣細(xì)胞。組織塊貼壁法1周后于組織塊間隙已可見散在分布的長條索狀紡錘型細(xì)胞

3、，3周左右細(xì)胞達(dá)到80％融合。膠原酶消化法，細(xì)胞接種后第2天即可見有少量形態(tài)各異的貼壁細(xì)胞，散在分布，1周左右時(shí)，貼壁細(xì)胞形成集落，占優(yōu)勢(shì)的是成纖維樣細(xì)胞，及少量鵝卵石樣細(xì)胞，至2周左右可達(dá)到80％融合。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，可得到較為純化的成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞約每3天即可達(dá)到90％～95％融合，需再次傳代或凍存，細(xì)胞可傳代20代以上。分別對(duì)第3代、第5代、第10代臍帶MSC行FACS檢測(cè)，結(jié)果表明各代間免疫表型無明顯差異，均強(qiáng)烈表達(dá)CD13、C

4、D29、CD105、CD44，弱表達(dá)CD106，不表達(dá)CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45。對(duì)第2、6、12代UCMSCs生長曲線進(jìn)行分析，表明其倍增時(shí)間分別為33.1h、34.4h、34.65h。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)液中加入BrdU后48小時(shí)，免疫組織化學(xué)染色顯示80％～90％細(xì)胞BrdU表達(dá)陽性。流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)表明，UCMSCs有80％～90％細(xì)胞處于G0-G1期。RT-PCR檢測(cè)示臍帶MSCOCT-4

5、mRNA表達(dá)陽性。透射電鏡觀察顯示臍帶MSC核大，不規(guī)則，核仁明顯，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)少；胞漿少，內(nèi)有少量細(xì)胞器，以粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體為主，胞漿內(nèi)有較多游離核糖體。 結(jié)論：組織快貼壁法和膠原酶消化法均可從臍帶組織提取到成纖維樣細(xì)胞。該細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，且具有不成熟的細(xì)胞核及胞漿內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，OCT-4表達(dá)陽性，顯示其具有干細(xì)胞特性。細(xì)胞表面分子檢測(cè)顯示該臍帶來源干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志與骨髓MSC相同，是間充質(zhì)干細(xì)胞的新成員。

6、作為從分娩廢棄物臍帶組織中提取到的干細(xì)胞，UCMSCs無倫理學(xué)限制，取材方便，為干細(xì)胞的研究及臨床應(yīng)用鋪平了道路。 第二部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的研究 目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSC)向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的條件及方法，以明確其神經(jīng)分化潛能，進(jìn)而為臍帶MSC的神經(jīng)移植提供理論依據(jù)。 方法：取第3，5，10代的MSC分別用三種不同的誘導(dǎo)方法

7、向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)。化學(xué)試劑誘導(dǎo)法首先將細(xì)胞置于預(yù)誘導(dǎo)液DMEM/F12+20％FBS+10ng/mlbFGF進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后去掉預(yù)誘導(dǎo)液，更換為誘導(dǎo)液(DMEM/F12+2％DMSO+200μMBHA+25μMKCL+2mM丙戊酸+10μM拂司扣林+1μM氫化可的松)，誘導(dǎo)5小時(shí)。丹參誘導(dǎo)法用同樣方法預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)后，更換為DMEM/F12+2％丹參注射液繼續(xù)誘導(dǎo)5小時(shí)。神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)法于培養(yǎng)基中添加bFGF(20ng/ml)，

8、EGF(20ng/ml)，全反式維甲酸(RA,0.5μM)，在37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)7天。誘導(dǎo)期間觀察細(xì)胞形態(tài)變化，誘導(dǎo)結(jié)束后，4％多聚甲醛固定細(xì)胞，分別用免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法檢測(cè)神經(jīng)元樣細(xì)胞特異性標(biāo)志物Nestin，NSE，NeuN，NF-M，β-tubulinⅢ，GFAP表達(dá)。比較不同代數(shù)UCMSCs神經(jīng)分化能力的差異。用RT-PCR法檢測(cè)神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)前后UCMSCs表達(dá)NSE、GFAPmRNA的差異。 結(jié)

9、果：化學(xué)誘導(dǎo)組加入誘導(dǎo)劑后0.5-1小時(shí)，UCMSCs即已出現(xiàn)形態(tài)變化，隨誘導(dǎo)時(shí)間延長，細(xì)胞形態(tài)變化愈加明顯，胞體伸出長長的突起，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞樣改變。多個(gè)細(xì)胞的突起有時(shí)相互連接形成網(wǎng)狀，類似樹突樣結(jié)構(gòu)。然而8-10小時(shí)后，部分細(xì)胞死亡，胞體漂浮。丹參誘導(dǎo)組加入丹參注射液后，部分細(xì)胞胞漿收縮，伸出突起，表現(xiàn)為神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，但細(xì)胞形態(tài)變化緩和，不如化學(xué)誘導(dǎo)組明顯。神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)組，隨時(shí)間延長，胞體漸拉長，有部分細(xì)胞逐漸形成絲狀突起，

10、細(xì)胞生長狀態(tài)良好，無明顯細(xì)胞漂浮或死亡現(xiàn)象。免疫組化法檢測(cè)顯示不同代數(shù)的UCMSCs經(jīng)化學(xué)試劑誘導(dǎo)后均表達(dá)Nestin，NSE，NeuN，NF-M，不表達(dá)GFAP。免疫熒光檢測(cè)顯示不同代數(shù)的UCMSCs經(jīng)丹參誘導(dǎo)后均表達(dá)Nestin，NSE，NF-M，β-tubulinⅢ，并有少量細(xì)胞表達(dá)GFAP。神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)組同樣顯示大量細(xì)胞Nestin，NSE，NF-M，β-tubulinⅢ表達(dá)陽性，并有少量細(xì)胞表達(dá)GFAP。RT-PCR顯示神

11、經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)前后NSEmRNA均有表達(dá)，但誘導(dǎo)后表達(dá)增加。GFAP則無論在誘導(dǎo)前后均未見表達(dá)。OCT-4mRNA表達(dá)在誘導(dǎo)后消失。 結(jié)論：UCMSCs經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)法、中藥誘導(dǎo)法、神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)法均可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，并表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物。表明UCMSCs具有神經(jīng)分化潛能。本研究為UCMSCs神經(jīng)移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病鋪平了道路。 第三部分人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞腦內(nèi)移植治療大鼠液壓沖擊腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察人

12、UCMSCs移植到正常大鼠腦組織移植后的存活、遷移及分化情況，并探討人UCMSCs腦內(nèi)移植對(duì)大鼠液壓沖擊腦損傷的治療作用及其機(jī)制。 方法：1、取生長狀況良好貼壁培養(yǎng)第6代以內(nèi)的人UCMSCs，分別用5-溴脫氧鳥嘧啶核苷(BrdU)或bis-benzimide(Hoechst33258)標(biāo)記細(xì)胞。 2、微量注射泵以1μl/min的速度向正常大鼠海馬CA1段注入10μl標(biāo)記的人UCMSCs細(xì)胞懸液(1×106個(gè)，D/F12混

13、懸)，細(xì)胞移植結(jié)束后根據(jù)動(dòng)物不同分組分別于移植后1周、2周、4周、6周時(shí)處死動(dòng)物，4％多聚甲醛灌注取材。于注射點(diǎn)部位冠狀切開，連續(xù)切片觀察移植細(xì)胞在腦組織內(nèi)的分布。行免疫組織化學(xué)檢測(cè)移植細(xì)胞NSE，GFAP，NF-M的表達(dá)情況。 3、制作大鼠液壓沖擊腦損傷模型。傷后24小時(shí)，向損傷灶周邊立體定向注入10ulBrdU標(biāo)記的UCMSCs細(xì)胞懸液(1×106個(gè)，D/F12混懸)，并設(shè)對(duì)照。分別于顱腦損傷前、傷后24小時(shí)、傷后48小時(shí)、

14、傷后1周、2周、3周、4周對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。顱腦損傷后4周，處死動(dòng)物并取材，于細(xì)胞移植位點(diǎn)連續(xù)冠狀切片，行BrdU免疫組織化學(xué)染色，并取BrdU陽性細(xì)胞相鄰切片分別行免疫組織化學(xué)染色觀察移植細(xì)胞NSE、GFAP的表達(dá)，細(xì)胞移植區(qū)域VEGF的表達(dá)。行Fitc-Bandeiraeasimplicifolialectin-1(Fitc-BSlectin-1)染色觀察損傷區(qū)微血管數(shù)量的變化。行TUNEL法原位標(biāo)記損傷區(qū)域凋亡細(xì)胞。

15、 結(jié)果：1、正常大鼠海馬C1段移植UCMSC后，移植細(xì)胞至少可存活6周以上，向注射點(diǎn)臨近腦組織移行超過1mm，并向遠(yuǎn)隔部位如室管膜下區(qū)遷移；免疫組織化學(xué)檢測(cè)表明部分移植細(xì)胞表達(dá)NSE、NF、GFAP。 2、大鼠液壓沖擊腦損傷后1-3周，TBI+UCMSCs移植組神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功功能評(píng)分顯著高于TBI+DF組、TBI組(p＜0.05)，損傷后4周，各組神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功較能評(píng)分均回復(fù)正常，組間無明顯差別(F=1.3，p＞0.1)。

16、 3、免疫組織化學(xué)檢查顯示部分移植細(xì)胞分別表達(dá)NSE、NF、GFAP。UCMSC移植組創(chuàng)傷區(qū)VEGF表達(dá)較對(duì)照組明顯增多。Fitc-BSlectin-1染色示UCMSC移植組創(chuàng)傷區(qū)皮層微血管密度明顯高于對(duì)照組。原位調(diào)亡染色顯示UCMSC移植組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組。 結(jié)論：人UCMSC大鼠腦組織內(nèi)移植后可長期存活，向室管膜下區(qū)遷移并有部分細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。臍帶間質(zhì)干細(xì)胞腦內(nèi)移植有助于促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷后的早期功能恢復(fù)，這種治療