黃芪多糖對不同氧濃度下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：
　　通過三氣培養(yǎng)箱模擬低氧微環(huán)境,研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)在低氧微環(huán)境下生物特征的變化及其向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的能力;探討黃芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)干預(yù)對低氧微環(huán)境中 MSCs的保護(hù)作用,為 MSCs更有效的應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.利用三氣培養(yǎng)箱建立細(xì)胞低氧模型。將組別分為 A、

2、B、C、D四組,A組為MSCs放置于常氧21％ O2的培養(yǎng)箱下進(jìn)行培養(yǎng);B組為 MSCs在低氧培養(yǎng)箱下(3%O2、5% O2、10% O2)進(jìn)行培養(yǎng),C組為常氧培養(yǎng)加入中藥 APS,D組為在低氧濃度下培養(yǎng)加入 APS,即 APS+3% O2、APS+5% O2、APS+10% O2。
　　2.通過倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞生長形態(tài)、MTT法檢測細(xì)胞生長曲線情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期的變化。
　　3.使用熒光染料羅丹明1

3、23、 Hochest33258通過激光共聚焦顯微鏡觀察各分組細(xì)胞線粒體膜電位表達(dá)的改變。
　　4.應(yīng)用經(jīng)典神經(jīng)誘導(dǎo)劑β-巰基乙醇,誘導(dǎo) MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化,通過甲苯胺藍(lán)染色檢測神經(jīng)細(xì)胞尼式小體表達(dá)量的變化。
　　5.采用 Western Blot方法檢測低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)與巢蛋白(Nestin)及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.倒置相差顯微鏡觀察顯示,A組常氧21%

4、 O2培養(yǎng)下 MSCs細(xì)胞形態(tài)均一,邊界清晰,呈梭形或紡錘形漩渦樣生長;B組低氧培養(yǎng)下 MSCs細(xì)胞核突出,細(xì)胞排列較為紊亂,數(shù)量明顯減少,細(xì)胞逐漸變得狹長、甚至出現(xiàn)不規(guī)則形狀,胞漿減少,其中3% O2的形態(tài)的改變比5% O2、10% O2較為明顯。
　　2. MTT結(jié)果顯示,常氧培養(yǎng)下 MSCs生長速度在7 d內(nèi)快于低氧培養(yǎng)下 MSCs。隨著氧濃度的降低,低氧3% O2、5% O2組細(xì)胞生長變慢,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)非參數(shù)檢驗(yàn)( K-多個(gè)獨(dú)

5、立樣本檢驗(yàn))分析,與常氧組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,低氧組3% O2、5% O2、10%O2的 G1期細(xì)胞比例分別為78.4%、56.7%、81.2%,S期細(xì)胞比例為10.1%、26%、16%。G2期細(xì)胞比例為11.5%、13.2%、2.09%。而常氧組 G1期細(xì)胞比例47.9%,S期細(xì)胞比例48%,G2期細(xì)胞比例4.08%。兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p<0.05)。
　　4.激光

6、共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位表明,低氧組(3% O2、5% O2)與常氧組相比線粒體膜電位表達(dá)量高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p<0.05)。APS+常氧組與常氧組相比變化不明顯( p>0.05),而 APS+低氧組(3% O2、5% O2、10% O2)與低氧組(3% O2、5% O2、10% O2)相比,膜電位變化不明顯( p>0.05)。
　　5.甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示,低氧組(3% O2、5% O2)尼氏小體表達(dá)與常氧組相比升高(

7、p<0.05);APS+常氧組尼氏小體表達(dá)與常氧組相比升高( p<0.05);APS+低氧組(3% O2、5% O2、10% O2)尼氏小體表達(dá)與低氧組(3% O2、5% O2、10% O2)相比升高(P<0.05)。
　　6. Wetern Blot檢測 NSE、Nestin、HIF-1α的結(jié)果顯示:
　?、?低氧組(3% O2、5% O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞 NSE蛋白表達(dá)較常氧組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p<0.05); AP

8、S+低氧組(3% O2、5% O2、10% O2)NSE蛋白較低氧組(3%O2、5% O2、10% O2)表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p<0.05)。
　　②.低氧組(3% O2、5% O2)Nestin蛋白表達(dá)量與常氧組相比升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p<0.05);APS+常氧組 Nestin蛋白表達(dá)量與常氧組相比升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p<0.05)。APS+低氧組(3% O2、5% O2、10% O2)Nestin蛋白表

9、達(dá)量與低氧組(3% O2、5% O2、10% O2)相比升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　?、?常氧組 HIF-1α表達(dá)量較低,而在低氧組中,HIF-1α表達(dá)量升高具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p<0.01)。APS+低氧組(3% O2)HIF-1α表達(dá)量與低氧組(3% O2)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p<0.05)。APS+低氧組(5% O2、10% O2)HIF-1α表達(dá)量與低氧組(5% O2、10% O2)相比無明顯意義

10、( p>0.05)。APS+常氧組 HIF-1α表達(dá)量與常氧組相比無明顯意義( p>0.05)。
　?、? Pearson相關(guān)性分析顯示,低氧組3% O2中 HIF-1α與 Nestin之間呈正相關(guān);與 NSE之間呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.低氧微環(huán)境誘導(dǎo)MSCs形態(tài)學(xué)改變,細(xì)胞生長速度受到抑制。
　　2.低氧微環(huán)境可促進(jìn)MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化,其分子機(jī)制可能與HIF-1α參與調(diào)控通路有關(guān)。
　　3.