人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞來源exosomes分離鑒定及其對(duì)細(xì)胞生長的影響.pdf

1、目的：
　　 分離培養(yǎng)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cordmesenchyrmal stem cells,hucMSCs),建立hucMSCs來源的外切體(hucMSCs-exosomes)分離純化方法,鑒定并初步分析其生物學(xué)特性;體外研究hucMSCs-exosomes對(duì)正常細(xì)胞的生長及氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷的作用。
　　 方法:采用臍帶組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)hucMSCs;利用超濾及密度梯度離心法

2、從hucMSCs的條件培養(yǎng)上清中分離并純化hucMSCs-exosomes,通過透射電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及Western blotting檢測exosomes表面相關(guān)標(biāo)志蛋白CD9、CD81,通過蛋白質(zhì)雙向電泳進(jìn)一步分析其蛋白構(gòu)成;將分離純化的hucMSCs-exosomes體外分別應(yīng)用于正常/過氧化氫損傷的大鼠心肌細(xì)胞(H9C2(2-1))、人肝細(xì)胞(HL-7702)、大鼠腎上皮細(xì)胞(NRK-52E)這三種細(xì)胞株,觀察hucMSCs-e

3、xosomes在體外對(duì)正常細(xì)胞的生長及氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷的干預(yù)作用;綜合運(yùn)用MTT、免疫組織化學(xué)等技術(shù)檢測hucMSCs-exosomes對(duì)正常細(xì)胞的促增殖作用及對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷的預(yù)防效果;運(yùn)用免疫熒光、Westem blotting、Luminex等技術(shù)尋找hucMSCs-exosomes影響細(xì)胞生長的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果:采用超濾及密度梯度離心法成功分離純化得到hucMSCs分泌的exosomes。透射電鏡下觀

4、察,hucMSCs-exosomes呈橢圓或碟形的囊泡狀結(jié)構(gòu),直徑約為40nm～100nm。hucMSCs-exosomes含有多種蛋白,并在不同的保存條件下有一定的穩(wěn)定性:蛋白質(zhì)雙向電泳的結(jié)果進(jìn)一步顯示人臍帶來源的exosomcs和人肺成纖維細(xì)胞來源的exosomes具有大量差異性表達(dá)的蛋白;Western blotting顯示exosomes表達(dá)標(biāo)記蛋白CD9、CD81。hucMSCs-exosomes對(duì)正常培養(yǎng)的H9C2(2-1)

5、、HL-7702、NRK-52E細(xì)胞株通過激活ERK1/2起到促增殖作用。對(duì)過氧化氫損傷的H9C2(2-1)、HL-7702、NRK-52E,則可在一定程度上逆轉(zhuǎn)細(xì)胞損傷,這可能通過活化MAPK通路中p38而起到抗凋亡作用。
　　 結(jié)論:采用超濾及密度梯度離心法可以成功從人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)上清中分離純化得到exosomes。hucMSCs來源的exosomes在體外能夠通過活化ERK1/2促進(jìn)細(xì)胞增殖,通過活化MAPK通