人臍帶間質(zhì)干細胞來源exosome在血管形成中的作用及其蛋白質(zhì)組學分析.pdf

1、目的:分離鑒定人臍帶間質(zhì)干細胞來源exosome(human umbilicalcord mesenchymal stem cells derived exosome, hucMSC-Ex)，研究hucMSC-Ex在血管形成中的作用，并對hucMSC-Ex進行蛋白質(zhì)組學分析。
　　方法:采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)hucMSC，并通過流式細胞術、成脂和成骨誘導實驗鑒定hucMSC;采用蔗糖密度梯度聯(lián)合超濾超速離心法從hucMSC的無血

2、清培養(yǎng)上清中分離并純化hucMSC-Ex，透射電鏡下觀察hucMSC-Ex的形態(tài)特征，Nanosight可視型納米顆粒分析儀檢測hucMSC-Ex的直徑分布情況，Western-blot檢測hucMSC-Ex表面標記CD9和HSP70，SDS-PAGE對hucMSC-Ex的蛋白質(zhì)組分進行初步分析;將分離純化的hucMSC-Ex體外作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926，綜合運用MTT、細胞計數(shù)、劃痕實驗、Transwell遷移實驗、基質(zhì)

3、膠小管形成實驗觀察hucMSC-Ex對EA.hy926細胞增殖、遷移和成管能力的影響，并運用Western-blot、免疫熒光、Luminex技術尋找hucMSC-Ex促進血管形成的可能機制;運用LC-MS/MS技術對hucMSC-Ex進行蛋白質(zhì)組學分析，并通過PANTHER軟件對這些蛋白質(zhì)進行分類和功能富集分析。
　　結(jié)果:成功分離得到hucMSC，高表達CD29、CD44、CD90和CD105，不表達CD34和HLA-DR，成

4、脂、成骨誘導試驗陽性;成功分離純化出的hucMSC-Ex為直徑在30～100nm左右的圓形或橢網(wǎng)形膜性小囊泡，具有特征性的“杯狀”結(jié)構(gòu)，表達exosome表面標記蛋白CD9和HSP70，且蛋白質(zhì)組分較hucMSC有明顯不同，均在55～70KD及170KD～處有富集;hucMSC-Ex在體外能夠呈濃度依賴性促進臍靜脈內(nèi)皮細胞EA.hy926的增殖、遷移和小管形成，并活化EA.hy926細胞中的Wnt/β-catenin信號通路;運用LC-

5、MS/MS從hucMSC-Ex中鑒定出499種蛋白質(zhì)，包括骨架/結(jié)構(gòu)蛋白、鈣結(jié)合蛋白、細胞外基質(zhì)/分泌蛋白、分子伴侶、粘附分子、受體、酶調(diào)節(jié)器、小GTP酶/GTP結(jié)合蛋白、激酶、代謝酶（包括水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、合成酶、異構(gòu)酶等）、核蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、分揀/運輸?shù)鞍?、免疫蛋白等，這些蛋白質(zhì)富含多種生物學功能，參與多種生物學過程，并涉及包括細胞增殖、遷移、粘附和血管形成相關信號通路在內(nèi)的80種信號通路。
　　結(jié)論:采用蔗糖密度梯

6、度聯(lián)合超濾超速離心法可以成功從hucMSC的無血清培養(yǎng)上清中分離純化得到exosome; hucMSC-Ex在體外能夠通過活化Wnt/β-catenin信號通路促進EA.hy926細胞增殖、遷移和小管形成，提示hucMSC-Ex可以通過促進新生血管形成來達到組織損傷修復的目的;采用LC-MS/MS對hucMSC-Ex進行蛋白質(zhì)組學分析，成功鑒定出499種蛋白質(zhì)，為進一步篩選出能有效改善組織損傷的一系列候選蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復合物提供實驗基礎