甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白對人肝星狀細(xì)胞的活化作用.pdf

1、背景：
　　 甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(Parathyroid hormone-related protein，PTHrP)最初是從與高鈣血癥相關(guān)的惡性腫瘤組織中分離出的一種多肽類物質(zhì)，PTHrP的活性位置位于1-34的氨基酸肽段，而成熟有活性的分泌形式為PTHrP(1-36)，PTHrP起作用的形式有內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌三種，主要為旁分泌形式，PTHrP自發(fā)現(xiàn)以來目前確定的內(nèi)分泌功能有三個，分別為:腫瘤來源導(dǎo)致骨吸收繼發(fā)高鈣血癥

2、，促進(jìn)正常乳腺泌乳，在胚胎時期維持胎盤鈣代謝平衡。PTHrP與甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)有著相似的結(jié)構(gòu)，PTHrP與其受體PTHR廣泛存在于體內(nèi)多種正常組織器官，參與血管生成、骨形成、乳腺發(fā)育等多種生理過程，但在不同種屬、不同組織中PTHrP可能與不同受體結(jié)合，產(chǎn)生不同的效應(yīng)。
　　 多年來PTHrP的研究大多關(guān)于骨骼和腫瘤方面，并已有多年的實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)其具有促進(jìn)骨質(zhì)形成的作用，臨床上有

3、應(yīng)用PTHrP促進(jìn)骨質(zhì)合成治療骨質(zhì)疏松癥，取得了良好的治療效果，為一種起效快、副作用少的骨形成促進(jìn)劑。但另一方面有個別研究顯示PTHrP可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生，且此作用與TGF-β1(transforming growth factor-β1)，EGF(endothelial growth factor)以及VEGF(vascular endothelial growth factor)等細(xì)胞因子密切相關(guān)。T

4、GF-β1是很強(qiáng)的促纖維因子，在各種纖維化過程中處于中心地位，包括肝纖維化，但關(guān)于PTHrP在肝臟中的作用尚未有系統(tǒng)的研究。
　　 肝纖維化(hepatic fibrosis)是各種慢性肝病進(jìn)展中由于肝內(nèi)纖維生成與降解失衡，導(dǎo)致過多的膠原在肝內(nèi)沉積，常伴發(fā)于慢性炎癥并可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝癌。促進(jìn)肝纖維化形成的細(xì)胞有:肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSCs)、Kuffer細(xì)胞、肝門成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)

5、胞，而肝星狀細(xì)胞是主要的膠原纖維來源。在肝臟損害過程中，一般認(rèn)為是凋亡的肝細(xì)胞會釋放ROS(reactive oxygenspecies)和一些炎癥趨化因子，使淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，上述的炎癥細(xì)胞會分泌可溶性的細(xì)胞因子如TGF-β1、TNF-α(tumor necrosis factor-α)、FGF(fibroblast growth factor)等，這些細(xì)胞因子可將HSCs激活為肌成纖維樣細(xì)胞（myfibroblasts）。HS

6、Cs的活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，現(xiàn)有的關(guān)于HSCs的兩個活化假說，其共同點(diǎn)是激活后該細(xì)胞本身可分泌更多的上述促進(jìn)纖維化的細(xì)胞因子，并產(chǎn)生膠原、蛋白聚糖等，使細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)大量堆積，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。而在HSCs的多種活化刺激物中TGF-β1處于中心地位，是最強(qiáng)的促纖維生成因子，其可活化HSCs并誘導(dǎo)膠原合成，而活化的HSCs自身也會分泌TGF-β1，形成一個正反饋環(huán)路。當(dāng)HSCs活化

7、后，其強(qiáng)烈表達(dá)α-SMA(alpha-smooth muscle actin)，此因子為成纖維細(xì)胞標(biāo)記物，為HSCs活化的標(biāo)志;另活化的HSCs還大量合成作為ECM主要組成成分的膠原蛋白(collagen)和膠原降解酶如金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)等，這些因子主要來源于HSCs。此過程的持續(xù)使得膠原沉積和肝功能損傷最終導(dǎo)致肝纖維化。
　　 PTHrP在正常肝臟中有表達(dá)，而早在1993年就

8、有報道內(nèi)毒素血癥時肝細(xì)胞內(nèi)PTHrP表達(dá)明顯增高并且PTHrP可引起肝內(nèi)細(xì)胞的急性炎癥損傷，上述結(jié)果表明PTHrP在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中可起細(xì)胞因子的作用。內(nèi)毒素血癥對于肝臟的作用早在1975年就已有報道，現(xiàn)今內(nèi)毒素在急慢性肝損傷中起重要作用的觀點(diǎn)已被廣泛接受，且其存在還與肝病的嚴(yán)重程度相關(guān)，但內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下PTHrP起何種作用尚未見報道，值得我們關(guān)注。隨后有研究對肝硬化患者血中PTHrP(1-84)濃度的測定發(fā)現(xiàn)與正常人相比沒有明顯的

9、增高，并且與病變的嚴(yán)重程度亦沒有相關(guān)性。但已有的體內(nèi)研究和我們前期研究均證實(shí)PTHrP在正常機(jī)體血循環(huán)中表達(dá)量非常低，甚至低于檢測標(biāo)準(zhǔn)的下限?，F(xiàn)已知PTHrP起作用可通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌三種模式，而最主要的是旁分泌途徑，因此盡管肝硬化患者血中PTHrP無明顯增高，亦不能排除其通過旁分泌或自分泌的途徑影響肝臟內(nèi)的其他細(xì)胞，因此PTHrP在肝內(nèi)分泌及作用非常值得進(jìn)一步的研究。
　　 現(xiàn)有的治療骨質(zhì)疏松的藥物主要包括拮抗骨吸收劑

10、和刺激骨形成劑兩大類，但對慢性肝病導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松療效欠佳，PTHrP的出現(xiàn)為我們提供了一個新的選擇，但PTHrP作為一種前景良好的骨形成促進(jìn)劑，卻具有促腎纖維化的作用，而且對肝臟的影響作用尚不明確;且慢性肝病內(nèi)毒素血癥時肝細(xì)胞中PTHrP明顯升高并可造成肝細(xì)胞的急性損傷，但具體機(jī)制尚不明確，而國內(nèi)外均未見PTHrP對肝內(nèi)各細(xì)胞影響的系統(tǒng)性研究。PTHrP作為治療骨質(zhì)疏松的藥物用于人體，其對正常人或患有慢性肝病的患者影響如何亦未見報道，因

11、此PTHrP對于肝臟的影響非常值得進(jìn)一步的探討。
　　 研究目的和意義肝星狀細(xì)胞的活化一直是肝纖維化研究中的熱點(diǎn)，因此PTHrP對肝星狀細(xì)胞的影響作用給我們提供了一個新的研究切入點(diǎn)，可為PTHrP作為治療手段提供藥理學(xué)依據(jù)，亦可揭示PTHrP引起肝內(nèi)細(xì)胞的急慢性損傷的病理機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 1、商業(yè)購買人肝星狀細(xì)胞兩株，分別為人肝星狀細(xì)胞的正常細(xì)胞株HSC和其活化株LX-2，分別予以不同濃度的PTH

12、rP(1-36)(0.1nM、1nM、10nM、100nM)處理不同時間段(6h、12 h、24 h、48 h)，后收集細(xì)胞總蛋白、總RNA及其細(xì)胞培養(yǎng)上清液;
　　 2、運(yùn)用相對定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-qPCR)及蛋白質(zhì)印跡方法(Western-blot)分別從基因水平及蛋白水平檢測上述處理后細(xì)胞產(chǎn)物的活化相關(guān)因子(α-SMA、MMP-2、collagenⅠ、TGF-β1);
　　 3、運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光方

13、法(Immunofluorescence)檢測PTHrP(1-36)(100 nM，48 h)處理后HSC和LX-2中α-SMA表達(dá)情況;
　　 4、運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法(ELISA)檢測PTHrP(1-36)(10-100nM，24-48 h)處理后HSC培養(yǎng)上清液中TGF-β1濃度變化（單位Pg/ml）;
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用多樣本均數(shù)比較

14、方差分析（ONEWAY-ANOVA），結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，其中RT-qPCR結(jié)果對照組統(tǒng)一量化為1，Western-blot結(jié)果對照組統(tǒng)一量化為100，所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P＜0.05為具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、我們從基因和蛋白兩個水平檢測了PTHrP(1-36)處理的兩種細(xì)胞中α-SMA、collagenⅠ（Ⅰ型膠原）、MMP-2（金屬蛋白酶-2）三個與肝星狀細(xì)胞活化密切相關(guān)的因子，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞在濃

15、度10-100nM處理24-48 h的條件下α-SMA呈現(xiàn)2-3倍的上調(diào)趨勢(P＜0.05);10-100nM處理24-48 h的條件下兩種細(xì)胞的MMP-2基因和蛋白水平呈現(xiàn)2-3倍的上調(diào)趨勢(P＜0.05);HSC在10-100nM處理24-48 h的條件下Ⅰ型膠原的基因和蛋白水平呈現(xiàn)約2倍的上調(diào)趨勢(P＜0.05)，而LX-2僅在100nM處理24-48 h的條件下出現(xiàn)Ⅰ型膠原基因和蛋白水平的上調(diào)(P＜0.05)。
　　 2

16、、運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光方法檢測PTHrP(1-36)處理后兩種細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)正常HSC對照組熒光基本缺如，而處理組與對照組相比出現(xiàn)活化標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)明顯增高，在LX-2細(xì)胞亦觀察到處理組比對照組稍升高。
　　 3、HSC經(jīng)PTHrP(1-36)處理后，出現(xiàn)TGF-β1的合成和分泌增高，在10-100nM處理24小時后可檢測到差異，其中在100 nM PTHrP處理48 h后，TGF-β1的基因和蛋白的相對表達(dá)量分別為2.963

17、±0.337和356.608±6.587，它們的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但LX-2需在濃度100nM處理48 h后才具有明顯差異。而HSC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的總TGF-β1為513.6425±82.9245 pg/ml，其對照組則為190.0733±11.642 pg/ml，兩者比較存在顯著性差異(P＜0.05)。
　　 主要結(jié)論：
　　 1、對于正常的人肝星狀細(xì)胞HSC，PTHrP(1-36)處理后可快速引起

18、該細(xì)胞的活化標(biāo)志蛋白α-SMA的強(qiáng)烈表達(dá)，以及collagenⅠ、MMP-2的表達(dá)增加，并誘導(dǎo)強(qiáng)促纖因子TGF-β1的合成和分泌，而上述效應(yīng)在PTHrP(1-36)濃度為10nM作用時間為24 h后即可檢測到，上述結(jié)果表明PTHrP(1-36)對正常人肝星狀細(xì)胞具有活化作用。
　　 2、對于已活化的人肝星狀細(xì)胞株LX-2，PTHrP(1-36)亦可引起α-SMA、collagenⅠ、MMP-2和TGF-β1的表達(dá)增加，其中α-S

19、MA、MMP-2和TGF-β1的增多在PTHrP(1-36)濃度為10nM作用時間為24 h后可檢測到，而collagenⅠ則在PTHrP(1-36)濃度為100 nM作用時間為24 h后方可檢測到，上述結(jié)果表明PTHrP(1-36)可使已活化的星狀細(xì)胞合成更多的促纖因子，但膠原的增加可能需要更高的濃度和更長時間。
　　 3、PTHrP(1-36)可引起正常人肝星狀細(xì)胞的活化，以及促使已活化的星狀細(xì)胞合成更多的促纖因子，在兩種細(xì)