黏著斑激酶相關(guān)非激酶對肝星狀細(xì)胞膠原代謝的調(diào)控作用.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis)是多種致病因子引起慢性肝病，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化的共同病理途徑，其實(shí)質(zhì)是肝臟內(nèi)病理性細(xì)胞外間質(zhì)(extraceUular matrix，ECM)的合成和降解失衡，表現(xiàn)為ECM的大量沉積，其中膠原占沉積ECM的80％以上，膠原中的Ⅰ型膠原占沉積ECM的70％以上。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是膠原合成和降解的關(guān)鍵細(xì)胞，因此調(diào)控HSC的膠原代謝是預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的

2、關(guān)鍵。 HSC的膠原合成和降解主要受基質(zhì)金屬蛋白酶調(diào)控，MT1-MMP(membrane-type matrix metalloproteinase-1，MT1-MMP)是近年新發(fā)現(xiàn)的可以降解Ⅰ型膠原的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶，它還可以通過激活MMP2(matrixmetalloproteinase-2，MMP2．)來促進(jìn)膠原的降解；TIMP-2(tissue inhibitors of matrix metalloproteinas

3、ea-2，TIMP-2)是MT1-MMP和MMP2的共同抑制因子，它可以通過抑制二者對膠原的降解上調(diào)膠原的合成。 HSC的膠原代謝受多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)處于整合素、生長因子等信號通路的交匯點(diǎn)?；A(chǔ)研究表明，F(xiàn)AK磷酸化后，對多種類型細(xì)胞的膠原代謝具有重要影響，其第397酪氨酸位點(diǎn)(Tyr<,397>)是自主磷酸化位點(diǎn)，該位點(diǎn)磷酸化后，可以順次激活其余磷酸化位點(diǎn)，放

4、大FAK催化活性。因此，可以說，Tyr<,397>是FAK發(fā)揮生物學(xué)功能的扳機(jī)點(diǎn)。 FAK的C-末端含有粘著斑激酶相關(guān)非激酶(FAK-relatednon-kinase，F(xiàn)RNK)，F(xiàn)RNK可以作為FAK的一種內(nèi)源性抑制因子，參與體內(nèi)FAK功能的負(fù)向調(diào)節(jié)。對許多細(xì)胞類型來說，F(xiàn)RNK的過量表達(dá)能夠影響其膠原代謝，但是FRNK對HSC膠原代謝的影響及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。 為此，應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將FRNK質(zhì)粒瞬時(shí)

5、轉(zhuǎn)染HSC，研究選擇性抑制FAK磷酸化對纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)刺激的HSC膠原代謝的影響，以及該過程中某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用。 目的： 應(yīng)用FRNK質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HSC，探討FRNK選擇性抑制FAK磷酸化對FN刺激的HSC膠原代謝的影響，以及該過程中MMP2、TIMP-2、MT1-MMP的表達(dá)變化。 方法： 應(yīng)用含2％胎牛血清、100 IU·mL<'-1>青霉素、100μg·mL<'-

6、1>鏈霉素、4mmol·L<'-1>谷氨酰胺及1 mol·L<'-1>HEPES的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5％CO<,2>條件下體外培養(yǎng)HSC。以FN刺激HSC增殖，根據(jù)Lipofectamine<' >Reagent提供的實(shí)驗(yàn)操作步驟，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下進(jìn)行FRNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分5組：①對照組(Con組)；②FN組(FN組)；③脂質(zhì)體組(Lip組)；④空質(zhì)粒組(nFRNK組)；⑤FRNK質(zhì)粒組(FRNK組)。②～⑤組中FN濃度

7、均為50μg·mL<'-1>。采用3H脯氨酸摻入技術(shù)測定各組HSC總膠原和Ⅰ型膠原的合成；Western blot及RT-PCR共擴(kuò)增技術(shù)檢測FRNK、MMP2、TIMP-2、MT1-MMP蛋白及其mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1、FRNK成功轉(zhuǎn)染HSC：Western blot顯示，在125 kD位置出現(xiàn)FAK雜交帶，光密度值分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AK蛋白表達(dá)量于轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h、72 h無明顯變化，.P>0.50

8、。同時(shí)在42 kD處出現(xiàn)FRNK雜交帶，隨轉(zhuǎn)染時(shí)間延長，F(xiàn)RNK表達(dá)逐漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染后48 h表達(dá)最強(qiáng)，72 h減弱，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異，P<0.01。說明FRNK轉(zhuǎn)染HSC成功，于轉(zhuǎn)染后48 h其表達(dá)最強(qiáng)，而FAK蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)染前后無明顯變化。 2、FRNK抑制HSC總膠原的合成：采用<'3>H脯氨酸摻入技術(shù)測定各組HSC總膠原的合成，發(fā)現(xiàn)經(jīng)FN處理后，F(xiàn)N組總膠原的合成顯著高于對照組，P<0.01，F(xiàn)N組、脂質(zhì)體組與空質(zhì)

9、粒組無顯著差異，P>0.05；而在FRNK轉(zhuǎn)染HSC 48h后總膠原的合成較空質(zhì)粒組有顯著下降，P<0.01.。表明在FN刺激下HSC總膠原的合成增加，用FRNK轉(zhuǎn)染FN刺激的HSC可有效抑制其總膠原的合成。 3、FRNK抑制HSC Ⅰ型膠原的合成：采用<'3>H脯氨酸摻入技術(shù)測定各組HSC Ⅰ型膠原的合成，發(fā)現(xiàn)經(jīng)FN處理后，F(xiàn)N組I型膠原的合成顯著高于對照組，P<0.05，F(xiàn)N組、脂質(zhì)體組與空質(zhì)粒組無顯著差異，.P>0.05；

10、而在FRNK轉(zhuǎn)染HSC 48 h后Ⅰ型膠原的合成較空質(zhì)粒組有顯著下降，P<0.01。表明在FN刺激下HSC Ⅰ型膠原的合成增加，用FRNK轉(zhuǎn)染FN刺激的HSC可有效地抑制其Ⅰ型膠原的合成。 4、FRNK上調(diào)MT1-MMP表達(dá)：Western blot顯示在66kD位置出現(xiàn)一條雜交帶，經(jīng)光密度測定分析顯示：FN刺激后，HSC MT1-MMP蛋白表達(dá)量明顯低于對照組(1.02±0.18vs 1.55±0.27)，降低了34.19％，

11、P<0.01；但與脂質(zhì)體組、空質(zhì)粒組比較無明顯差異，P>0.05。FRNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC 48 h后，MT1-MMP蛋白表達(dá)量顯著升高(2.25±0.54 vs0.99±0.88)，較空質(zhì)粒組升高51.77％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異，P<0.01。FRNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC 10 h后，RT-PCR共擴(kuò)增檢測MT1-MMP和內(nèi)參照β-actin的基因表達(dá)，掃描結(jié)果分析顯示：FN刺激后，HSC MT1-MMP mRNA表達(dá)量明顯低于對照組(

12、0.99±0.14 vs 1.26±0.17)，P<0.01。FN組、脂質(zhì)體組與空質(zhì)粒組之間無明顯差異，P>0.50；FRNK質(zhì)粒組MT1-MMP mRNA表達(dá)較空質(zhì)粒組明顯增加(1.58±0.18.vs1.00±0.10)，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。 5、FRNK上調(diào)MMP2的表達(dá)：Westem blot顯示在62 kD位置出現(xiàn)一條雜交帶，經(jīng)光密度測定分析顯示：FN刺激后，HSC MMP2蛋白表達(dá)量明顯低于對照組(1.1

13、3±0.17 vs1.46±0.20)，降低了22.60％，P<0.01；但與脂質(zhì)體組、空質(zhì)粒組比較無明顯差異，P>0.05。FRNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC 48 h后，MMP2蛋白表達(dá)量顯著升高(2.26±0.14 vs 1.09±0.15)，較空質(zhì)粒組升高51.77％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異，P<0.01。FRNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC 10 h后，RT-PCR共擴(kuò)增檢測MMP2和內(nèi)參照β-actin基因表達(dá)，掃描結(jié)果分析顯示：FN刺激后，HSC

14、 MMP2 mRNA表達(dá)量明顯低于對照組(0.97±0.07 vs1.26±0.10)，P<0.01。FN組、脂質(zhì)體組與空質(zhì)粒組之間無明顯差異，P>0.50；FRNK質(zhì)粒組MMP2 roRNA表達(dá)較空質(zhì)粒組明顯增加(1.65±0.04 vs 0.99±0.03)，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。 6、FRNK抑制TIMP-2蛋白表達(dá)：Western blot顯示在21 kD位置出現(xiàn)一條雜交帶，經(jīng)光密度測定分析顯示：FN刺激后，H

15、SC TIMP-2蛋白表達(dá)量明顯高于對照組(2.26±0.13 vs1.44±0.09)，升高了36.28％，P<0.01；但與脂質(zhì)體組、空質(zhì)粒組比較無明顯差異，P>0.05。FRNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC 48 h后，TIMP-2蛋白表達(dá)量顯著降低(1.14±0.10 vs 2.23±0.15)，較空質(zhì)粒組升高48.88％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異，P<0.01。FRNK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC 10 h后，RT-PCR共擴(kuò)增檢測TIMP-2和內(nèi)參照B

16、.actin基因表達(dá)，掃描結(jié)果分析顯示，F(xiàn)N刺激后，HSC MMP2蛋白表達(dá)量明顯低于對照組，P<0.01。FN組、脂質(zhì)體組與空質(zhì)粒組之間無明顯差異，P>0.50；FRNK質(zhì)粒組TIMP-2 mRNA表達(dá)較空質(zhì)粒組明顯降低(0.97±0.04 VS1.69±0.04)，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。 7、MMP2/TIMP-2比值升高：分別把各組中MMP2、TIMP-2翻譯和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)作一比值，可見在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平，外源性