PTEN過(guò)表達(dá)及突變對(duì)活化肝星狀細(xì)胞骨架蛋白actin及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響.pdf

1、目的：探討過(guò)表達(dá)野生型第10號(hào)染色體缺乏的磷酸酶張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten, PTEN）和其突變體G129E（僅保有蛋白磷酸酶活性而失去脂質(zhì)磷酸酶活性）對(duì)體外培養(yǎng)的活化的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSC）骨架蛋白actin及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。
　　方法：研究需要的腺病毒（AD-PTE

2、N, AD-G129E, AD-GFP）應(yīng)用AD293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，并測(cè)量滴度；體外培養(yǎng)活化的大鼠HSC（HSC-T6細(xì)胞系），借助腺病毒將具有雙重特異性磷酸酶活性的過(guò)表達(dá)的野生型PTEN基因和其突變后僅具有蛋白磷酸酶活性的G129E基因轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞；使用Western blot和Real-time PCR檢驗(yàn)肝星狀細(xì)胞的PTEN蛋白和mRNA的表達(dá)；借助激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal micro

3、scope, LSCM），采用鈣熒光探針Rhod-2/AM負(fù)載檢測(cè)肝星狀細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明（Tetramethylrhodamine isothiocyanate,TRITC）標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽檢測(cè)HSC的形態(tài)、F-actin的分布及熒光強(qiáng)度、偽足以及應(yīng)力纖維的變化。全部研究?jī)?nèi)容都使用Excel2003建立資料庫(kù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差

4、分析（one-way ANOVA），組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究分4組：1 Control：用只含有8％胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染步驟用DMEM代替病毒液；2 AD-GFP組：轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的對(duì)照空病毒AD-GFP；3 AD-PTEN組：將含有過(guò)表達(dá)的PTEN基因并能合成GFP的重組腺病毒AD-PTEN轉(zhuǎn)染HSC；4 AD-G129E組：將含有G129E基因并能合成GFP的重組腺

5、病毒AD-G129E轉(zhuǎn)染HSC。
　　結(jié)果：1、通過(guò)腺病毒反復(fù)感染人胚腎細(xì)胞（AD293）的方法擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需的腺病毒，Ad-PTEN滴度為1.3×109pfu/mL、Ad-G129E滴度為1.4×109pfu/mL及Ad-GFP滴度為1.6×109pfu/mL。2、M.O.I.值100時(shí)，腺病毒轉(zhuǎn)染HSC后48h，計(jì)數(shù)GFP熒光陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，測(cè)得AD-GFP、AD-PTEN及AD-G129E各組腺病毒轉(zhuǎn)染率均＞80%。3、腺病毒轉(zhuǎn)

6、染后48h，應(yīng)用Western blot方法檢驗(yàn)每組HSC的PTEN蛋白顯示：AD-PTEN組（1.08±0.07）、AD-G129E組（0.97±0.04）明顯高于 Control（0.56±0.05）及 AD-GFP（0.69±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而Control與 AD-GFP組和AD-PTEN組與AD-G129E組之間都沒(méi)有明顯差別（P＞0.05）。使用 Real-time PCR方法檢驗(yàn) mRNA表達(dá)

7、顯示：AD-PTEN組（6.11.±0.072）、AD-G129E組（6.167±0.047）明顯高于Control（7.043±0.036）及 AD-GFP（6.990±0.037），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而Control與AD-GFP組和AD-PTEN組與 AD-G129E組之間都沒(méi)有明顯差別（P＞0.05）。4、TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽檢測(cè)顯示：Control組與AD-GFP組HSC多呈星形或多邊體形，F(xiàn)-actin重

8、構(gòu)形成大量粗大的應(yīng)力纖維，橫跨于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞周圍可見(jiàn)層狀偽足；AD-PTEN組及AD-G129E組HSC多為梭形，F(xiàn)-actin主要分布于細(xì)胞周邊，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量纖細(xì)的應(yīng)力纖維，細(xì)胞周邊層狀偽足消失；F-actin的熒光強(qiáng)度 AD-PTEN組（357.67±13.39）、AD-G129E組（377.25±14.55）明顯低于Control組（961.87±27.33）及AD-GFP組（954.68±20.71）， P＜0.05，而

9、AD-PTEN組與AD-G129E組以及Control組與AD-GFP組之間沒(méi)有明顯差別， P＞0.05。5鈣熒光探針 Rhod-2/AM檢測(cè) HSC內(nèi)鈣離子濃度顯示：AD-PTEN組（251.60±90.88）及 AD-G129E組（352.18±146.01）明顯低于 Control組（1953.95±132.99）及Ad-GFP組（1937.57±115.17），P＜0.05，而AD-PTEN組與AD-G129E組以及Contro